光穿孔による個体脳単一ニューロン遺伝子改変法の開発

2011 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 23650204
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 狩野 方伸 東京大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (40185963)
• 研究期間 (年度): 2011-04-28 – 2013-03-31
• キーワード: 神経科学 / ２光子イメージング / 遺伝子発現

研究概要

本研究では、生きた動物個体の脳において、任意の神経細胞に光を用いて自由に遺伝子導入できる技術を開発する事を目的としている。フェムト秒パルスレーザーを用いて細胞膜の光穿孔を行うことで、広い範囲（500ミクロン四方）に分布する多数（100個程度）のニューロン一つ一つに独立に外来遺伝子を導入することを可能にする。従来の単一細胞電気穿孔法と異なり、遺伝子を導入するために電極を接触させる必要がないため、侵襲性も少なく、極めて自由度の高い方法となり得る。開発した技術を用いることで、2光子イメージングにて活動を記録した複数のニューロンに選択的に外来遺伝子を導入して、その活動を制御することが可能となる。まず、光穿孔による遺伝子導入を行う前に、レーザーを用いて外来分子をニューロンに導入できるかどうかの確認を行なった。細胞膜を透過しない蛍光分子を細胞外に満たし、細胞膜付近でパルスレーザーを照射した。その結果、脳スライス標本および個体脳において光照射したニューロンに選択的に蛍光分子が取り込まれることが確認された。強い光を照射することによるニューロンへのダメージが起こらないかどうかを確認するため、蛍光デキストランを光照射により導入し、24時間後に再度観察したところ、ニューロンの形態に異常は見られず、光照射によるダメージによりニューロンの細胞死などは起こらないことが確認された。これらの条件検討をふまえ、現在、DNAプラスミドを光照射により導入することを試みている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

マウス個体において、光穿孔により外来分子を導入でき、光照射によるニューロン生存率にも影響がないことが確認されており、計画通りに研究が進んでいる。

今後の研究の推進方策

これまでの技術開発は順調に進んでおり、現在、DNAの導入を試みているところである。現在までのところ、研究計画の変更を必要とするような困難は発生しておらず、特に問題はない。

次年度の研究費の使用計画

カルシウムセンサーや光活性化チャネルの遺伝子導入に必要なDNAプラスミドを調整するための試薬類、プラスチック器具を多く必要とするため主にこれらを購入するために研究費を使用する。また、実験動物としてマウスを使用するが、遺伝子発現の効率向上の条件検討が必要なため、ある程度多くの数のマウスを必要とする。成果発表のための国内学会参加費・旅費に使用する。

研究成果

• [雑誌論文] Locally synchronized synaptic inputs. (2012)
  • 著者名/発表者名: Takahashi, N., Kitamura, K., Matsuo, N., Mayford, M., Kano, M., Matsuki, N., Ikegaya, Y.
  • 雑誌名: Science 巻: 335 ページ: 353-356
  • DOI: 10.1126/science.1210362
  • 査読あり
• [雑誌論文] CaV2.1 in cerebellar Purkinje cells regulates competitive excitatory synaptic wiring, cell survival, and cerebellar biochemical compartmentalization. (2012)
  • 著者名/発表者名: Miyazaki, T., Yamasaki, M., Hashimoto, K., Yamazaki, M., Abe, M., Usui, H., Kano, M., Sakimura, K., Watanabe, M.
  • 雑誌名: J. Neurosci. 巻: 32 ページ: 1311-1328
  • DOI: 10.1523/JNEUROSCI.2755-11.2012
  • 査読あり
• [雑誌論文] 小脳プルキンエ細胞樹状突起活動の in vivo イメージング (2012)
  • 著者名/発表者名: 喜多村和郎、橋本浩一、狩野方伸
  • 雑誌名: 生体の科学 巻: 63 ページ: 26-33
  • DOI: N/A
• [雑誌論文] Synaptogenesis and synaptic elimination. (2012)
  • 著者名/発表者名: Kano, M., Watanabe, M.
  • 雑誌名: Handbook of Cerebellum and Cerebellar Disorders 巻: In press ページ: In press（掲載確定）
  • DOI: N/A
  • 査読あり
• [雑誌論文] GABAergic inhibition regulates developmental synapse elimination in the cerebellum. (2012)
  • 著者名/発表者名: Nakayama, H., Miyazaki, T., Kitamura, K., Hashimoto, K., Yanagawa, Y., Obata, K., Sakimura, K., Watanabe, M., Kano, M.
  • 雑誌名: Neuron 巻: In press ページ: In press（掲載確定）
  • DOI: N/A
  • 査読あり
• [雑誌論文] A role for myosin Va in cerebellar plasticity and motor learning: a possible mechanism underlying neurological disorder in myosin Va disease. (2011)
  • 著者名/発表者名: Miyata, M., Kishimoto, Y., Tanaka, M., Hashimoto, K., Hirashima, N., Murata, Y., Kano, M., Takagishi, Y.
  • 雑誌名: J. Neurosci. 巻: 31 ページ: 6067-6078
  • DOI: 10.1523/JNEUROSCI.5651-10.2011
  • 査読あり
• [雑誌論文] In vivo two-photon uncaging of glutamate revealing the structure-function relationships of dendritic spines in the neocortex of adult mice. (2011)
  • 著者名/発表者名: Noguchi, J., Nagaoka, A., Watanabe, S., Ellis-Davies, G.C., Kitamura, K., Kano, M., Matsuzaki, M., Kasai, H.
  • 雑誌名: J. Physiol. 巻: 589 ページ: 2447-2457
  • DOI: 10.1113/jphysiol.2011.207100
  • 査読あり
• [雑誌論文] Postsynaptic P/Q-type Ca2+ channel in Purkinje cell mediates synaptic competition and elimination in developing cerebellum. (2011)
  • 著者名/発表者名: Hashimoto, K., Tsujita, M., Miyazaki, T., Kitamura, K., Yamazaki, M., Shin, H-S., Watanabe, M., Sakimura, K., Kano, M.
  • 雑誌名: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 巻: 108 ページ: 9987-9992
  • DOI: 10.1073/pnas.1101488108
  • 査読あり
• [雑誌論文] Developmental switching of perisomatic innervation from climbing fibers to basket cell fibers in cerebellar Purkinje cells. (2011)
  • 著者名/発表者名: Ichikawa, R., Yamasaki, M., Miyazaki, T., Konno, K., Hashimoto, K., Tatsumi, H., Inoue, Y., Kano, M., Watanabe, M.
  • 雑誌名: J. Neurosci 巻: 31 ページ: 16916-16927
  • DOI: 10.1523/JNEUROSCI.2396-11.2011
  • 査読あり
• [雑誌論文] Climbing fiber synapse elimination in cerebellar Purkinje cells. (2011)
  • 著者名/発表者名: Watanabe, M., Kano, M.
  • 雑誌名: Eur. J. Neurosci. 巻: 34 ページ: 1697-1710
  • DOI: 10.1111/j.1460-9568.2011.07894.x
  • 査読あり
• [学会発表] Refinement of Climbing Fiber to Purkinje Cell Synapses during Postnatal Cerebellar Development. (2012)
  • 著者名/発表者名: Kano, M.
  • 学会等名: 1st International Syposium / 59th NIBB Conference(招待講演)
  • 発表場所: 岡崎コンファレンスセンター（愛知県）
  • 年月日: 2012年3月11日
• [学会発表] Activity-dependent maturation of climbing fiber to Purkinje cell synapses during postnatal cerebellar development. (2011)
  • 著者名/発表者名: Kano, M.
  • 学会等名: 4th International Symposium of the Society for Research on the Cerebellum(招待講演)
  • 発表場所: 東京大学（東京都）
  • 年月日: 2011年9月18日
• [学会発表] Roles of Purkinje cell activity in climbing fiber synapse elimination in an organotypic coculture preparation of the cerebellum and medulla oblongata. (2011)
  • 著者名/発表者名: Mikuni, T., Uesaka, M., Kano, M.
  • 学会等名: 第34回日本神経科学大会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県）
  • 年月日: 2011年9月17日
• [学会発表] Postsynaptic P/Q type voltage-dependent Ca2+ channel is involved in refinement of cerebellar climbing fiber to Purkinje cell synapses in early postnatal development. (2011)
  • 著者名/発表者名: Hashimoto, K., Tsujita, M., Miyazaki, T., Kitamura, K., Yamazaki M., Shin, H-S, Watanabe M., Sakimura K., Kano, M.
  • 学会等名: 第34回日本神経科学大会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県）
  • 年月日: 2011年9月17日
• [学会発表] Enhanced synchrony of climbing fiber-induced Ca2+ signaling in cerebellar Purkinje cells in GluD2 (GluRδ2) knockout mouse. (2011)
  • 著者名/発表者名: Hashizume, M., Kitamura, K., Sakimura, K., Kano, M.
  • 学会等名: 第34回日本神経科学大会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県）
  • 年月日: 2011年9月16日
• [学会発表] Desynchronization of cerebellar Purkinje cell population activity during postnatal development. (2011)
  • 著者名/発表者名: Good, J.K., Kitamura, K., Kano, M.
  • 学会等名: 第34回日本神経科学大会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県）
  • 年月日: 2011年9月15日
• [学会発表] Activity-dependent synapse elimination during postnatal development. (2011)
  • 著者名/発表者名: Kano, M.
  • 学会等名: Gordon Research Conference on Cerebellum(招待講演)
  • 発表場所: Colby-Sawyer Colloge（アメリカ）
  • 年月日: 2011年8月24日
• [学会発表] Requirement of type 1 metabotropic glutamate receptor for experience-dependent pruning of retinogeniculate synapses. (2011)
  • 著者名/発表者名: Narushima, M., Uchigashima, M., Hashimoto, K., Aiba, A., Watanabe, M., Miyata, M., Kano, M.
  • 学会等名: 8th IBRO World Congress of Neuroscience, 2011
  • 発表場所: Fortezza da Basso（イタリア）
  • 年月日: 2011年7月18日
• [学会発表] Activity-dependent refinement of climbing fiber to Purkinje cell synapses during postnatal development. (2011)
  • 著者名/発表者名: Kano, M.
  • 学会等名: Symposium on Organization and Function of Neuronal Circuits in Movement Control(招待講演)
  • 発表場所: Trolleholm Castle（スウェーデン）
  • 年月日: 2011年5月28日
• [学会発表] Activity-dependent refinement of climbing fiber to Purkinje cell synapses during postnatal cerebellar development. (2011)
  • 著者名/発表者名: Kano, M., Hashimoto, K., Kawamura, Y., Nakayama, H., Kitamura, K., Sakimura K.
  • 学会等名: COLD SPRING HARBOR ASIA CONFERENCE: "Assembly, Plasticity, Dysfunction and Repair of Neural Circuits"(招待講演)
  • 発表場所: 蘇州 Dushu Lake Conference Center（中国）
  • 年月日: 2011年10月19日