プロテインキナーゼＣの生体内での基質の網羅的探索

2012 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 23650214
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 饗場 篤 東京大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20271116)
• キーワード: 脳分子プロファイリング

研究概要

本研究では、マウス脳のリン酸化プロテオミクスによってプロテインキナーゼC（PKC)gammaの基質を同定し、小脳機能におけるPKCシグナルの重要性を明らかにすることを試みた。昨年度までにPKCgammaノックアウトマウス(KO)の作製と小脳におけるリン酸化ペプチドの相対定量を行った。その結果、PKCgamma KOにおいて特にリン酸化の低下が顕著であった117種類のタンパク質を同定することができた。本年度はこれらの基質候補タンパク質の機能を解析するために下記の実験を行った。
（１）リン酸化候補タンパク質の発現解析
PKCgamma KOにおいてリン酸化量が大きく低下していた3つのタンパク質（Protein NDRG4, diacylglycerol kinase zeta, Serine/Threonine kinase Tao1）について、mRNAの発現解析を行った。マウス小脳よりtotal RNAを調製し、oligo-dTプライマーによって逆転写を行った。次に、それぞれの遺伝子についてリアルタイムPCRによって、mRNAの発現量を比較した。その結果、それぞれの遺伝子の発現量に野生型とKOとの間に大きな変化は見られなかった。このことからPKCgamma KOにおけるリン酸化量の低下は遺伝子発現量の変化によるものではないことを確認することができた。
（２）リン酸化ペプチドに対する抗体の作製
上記三種類のタンパク質についてリン酸化抗体の作製を行った。それぞれのタンパク質に対して、MS/MSによって同定されたアミノ酸残基がリン酸化されたペプチドを合成し、ウサギに接種した。ELISAによって抗体価の上昇したウサギより全採血を行い、抗血清を得た。現在これらの抗血清を用いて、ウエスタンブロットによるリン酸化量の変動解析と、免疫染色によるプルキンエ細胞における局在解析を行っている。

研究成果

• [雑誌論文] Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (RAC1) regulates glucose-stimulated insulin secretion via modulation of F-actin (2013)
  • 著者名/発表者名: Asahara S, Shibutani Y, Teruyama K, InoueHY, Kawada Y, Etoh H, Matsuda T,Kimura-Koyanagi M, Hashimoto N, Sakahara M, Fujimoto W, Takahashi H, Ueda S, Hosooka T, Satoh T, Inoue H, Matsumoto M, Aiba A, Kasuga M, Kido Y
  • 雑誌名: Diabetologia
  • DOI: DOI:10.1007/s00125-013-2849-5
  • 査読あり
• [雑誌論文] Guidepost neurons for the lateral olfactory tract: Expression of metabotropic glutamate receptor 1 and innervation by glutamatergic olfactory bulb axons (2012)
  • 著者名/発表者名: Hirata T, Kumada T, Kawasaki T, Furukawa T, Aiba A, Conquet F, Saga Y, Fukuda A
  • 雑誌名: Developmental Neurobiology 巻: 72 ページ: 1559-1576
  • DOI: DOI:10.1002/dneu.22030
  • 査読あり
• [雑誌論文] Functional coupling of the metabotropic glutamate receptor, InsP3 receptor and L-type Ca2+ channel in mouse CA1 pyramidal cells (2012)
  • 著者名/発表者名: Kato HK
  • 雑誌名: Journal of Physiology 巻: 590 ページ: 3019－3034
  • DOI: 10.1113/jphysiol.2012.232942
  • 査読あり
• [学会発表] 中枢神経系において恒常的活性化型mTORを発現するマウスの作製と解析 (2012)
  • 著者名/発表者名: 饗場 篤
  • 学会等名: 日本分子生物学会
  • 発表場所: 福岡国際会議場（福岡県）
  • 年月日: 20121211-20121214
• [備考] 東京大学大学院医学系研究科疾患生命工学センター動物資源学部門ホームページ
  • URL: http://lar.cdbim.m.u-tokyo.ac.jp/index.html