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医学・生物学研究においてES細胞は重要なバイオリソースである。特にノックアウトラット作製のために生殖系列移行能力が高いES細胞は必要不可欠である。本計画は、未分化細胞を可視化及び薬剤選別可能なES細胞樹立しキメララット作製方法の検討を行うことを目的とした。細菌人工染色体（BAC）に導入されたラットNanogゲノムの第１エクソンに可視化のためVenus遺伝子さらにIRESを挟みその下流にピューロマイシン耐性遺伝子を相同組換えしたNanog-Venus-puro （NVP）BAC遺伝子を構築した。この直鎖化したNVP BAC遺伝子はWIラットの受精卵前核に導入し、NVB BACファウンダーラットを作製した。この外来遺伝子が未分化細胞特異的にVenusを発現させるか検討するため、NVB BACラット胚盤胞内部細胞塊を解析、結果、強いVerus蛍光が確認され、NVB遺伝子が個体レベルで機能することが明らかとなった。次にこのNVBラット胚盤胞よりES細胞の樹立を試みが、GSK3やMEKインヒビターを用いた標準的培養法ではES様コロニーが形成されず、ラット系統によりES細胞樹立のための培養法を改善する必要があることも明らかとなった。そこで我々は、LEラットから常法に従って樹立したラットES細胞にNVB BACベクターを用い導入し、継代可能なラットNVP ES細胞を作製した。この細胞ではVenus蛍光とピューロマイシン耐性が確認された。そこでVenus陽性ES細胞を用いキメララットの作製を実施したが、生殖系列移行キメララットは得られなかった。現在、より未分化性が強いと思われるピューロマイシン抵抗性ES細胞を用い個体レベルで生殖系列移行を確認中である。本研究によって作製されたRat Nanog-Venus-puro （NVP）BACラットはNBRに寄託するため準備中である。
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