| 研究課題/領域番号 |
23650274
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| 研究機関 | 東京慈恵会医科大学 |
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研究代表者 |
福田 紀男 東京慈恵会医科大学, 医学部, 准教授 (30301534)
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| 研究分担者 |
照井 貴子 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (10366247)
小比類巻 生 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (40548905)
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| 研究期間 (年度) |
2011-04-28 – 2014-03-31
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| キーワード | バイオイメージング / ナノバイオロジー / 生体情報・計測 / 細胞・組織 / 生理学 |
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| 研究概要 |
本研究の目的は、生きた小動物（ラット、マウス）個体の心臓から心筋細胞内ナノ領域の分子情報を抽出する新しいシステムを開発することである。これにより、心臓の生理学的機能および病態メカニズムを分子レベルで解明し、心疾患の早期にどのような変化が見られるかを明らかにする。H.23年度、心筋サルコメアのZ線に大量に含まれるαアクチニンの抗体と明るくシャープな蛍光を発する蛍光ナノ粒子（量子ドット：QD）の複合体をin vivoラットの心臓に負荷した。その結果、心臓表面からの観察により約2.0 um周期の横紋様構造が確認された。心臓の切片を電顕にて観察すると、多くのQDがT管（心筋ではZ線に沿って存在）に局在していたが、Z線付近にも一部のQDが存在していた。さらにこの方法を、遺伝子工学の手法を用いて改良した。すなわち、アデノウイルスベクターを用いてin vivoマウスの心筋細胞のZ線にα-actinin-GFPを発現させた。マウスを麻酔下で開胸し、拍動中のサルコメアを高速で観察するとともに、心電図や心臓内圧（心臓カテーテルを左心室内へ挿入することによって測定）といったマクロパラメータを同時に計測した。カメラ速度は100 fpsである。これにより、in vivoマウス心臓の生理的状態を、マクロパラメータを用いて客観的に評価しつつサルコメア長計測を行うことが可能になった。サルコメア長の計測精度は10 nmである。現在、ピエゾシステムを顕微鏡に加えることによってフィードバックをかけ、心臓の拍動周期に合わせて対物レンズの位置を変えながら焦点を自動的に合わせるシステムを構築している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の目的は、生きた動物の心臓から心筋細胞内ナノ領域の分子情報を抽出するシステムを開発することである。これを基盤技術として、新しい心疾患早期診断装置の開発に挑む。H.23年度、生理学・医学分野で既に確立されているマクロパラメータ（心電図、心臓内圧）と同時に、最も重要な心筋細胞内パラメータの一つであるサルコメア収縮波形を捉えることに成功した（現在、論文作成中）。これは、世界で初めてのことであり、本研究が目指す心疾患診断装置開発に向けて大きなステップを踏み出したと言える。したがって、現在までのところ、おおむね順調に進んでいると判断している。
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| 今後の研究の推進方策 |
H.24年度には、先ず、H.23年度に構築した顕微システムの計測精度を上げる。心臓は周期的な拍動を伴う臓器であるため、高精度での細胞内観察は困難とされてきたが、我々はカメラ速度を上げ、さらにピエゾシステムを組み入れることによって、Z軸方向の焦点のズレを克服することに成功しつつある。したがって、この装置系の構築を完成させ、~2 nm、~2 msの空間、時間分解能を安定して出せるようにする。これにより、in vivoにおいて、心筋細胞内分子情報を正確に捉えることを目指す。さらに、GFPだけでなく、Ca濃度に応じて蛍光強度を変えるGCaMP2をZ線に発現させ、細胞内Caとサルコメア長との同時計測を目指す。GCaMP2については、蛍光強度をイメージングすることによって心筋細胞内ナノ領域でのCaを、隣接するGCaMP2の蛍光の間隔を測定することによってサルコメア長を計測する。先ず、正常動物において検討を行い、in vivoにおける心筋細胞の興奮と収縮の関係（興奮収縮連関：特に、細胞内Caとサルコメア収縮との関係）を明らかにする。次に、我々が開発した心筋イメージング法を、制御タンパク質であるトロポニンTに変異をノックインした拡張型心筋症マウスに応用する。正常心筋と比べ、興奮収縮連関がどのように変化しているかを明らかにし、将来の病態診断につなげる。H.25年度にはヒトへの応用を目指し、量子ドットと心筋細胞の表面に発現している受容体（α1Aアドレナリン受容体：心筋細胞のT管に豊富に存在）を認識する抗体の複合体をマウスに静脈内投与し、in vivoイメージングを行う。心筋細胞では、T管とZ線は並走しているため、T管のイメージングを行うことによりサルコメア、すなわち収縮情報を得ることができると考えている。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
H.24年度の研究費は、H.23年度に引き続き、主に試薬、実験動物とその飼育維持費、ガラス器具等の消耗品に500千円程度を当てる予定である。また、培養細胞の維持にアルバイトが必要なため、謝金として300千円程度を当てる。
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