タグ技術を用いた多数SS結合蛋白質の新規改変法及び優れた最小ルシフェラーゼの開発

2012 年度 研究成果報告書

• 研究課題/領域番号: 23651213
• 研究種目: 挑戦的萌芽研究
• 配分区分: 基金
• 研究分野: 生物分子科学
• 研究機関: 東京農工大学
• 研究代表者: 黒田 裕 東京農工大学, 大学院・工学研究院, 准教授 (10312240)
• 研究期間 (年度): 2011 – 2012
• キーワード: SS結合ミスマッチ / 折り畳み / 溶解度向上タグ / 可溶化タグ / 逆相HPLC / 天然状態 / 生物発光 / SEPタグ

研究概要

発光活性を有する標識蛋白質(レポーター蛋白質;GFPなど)を用いたバイオイメージングは、分子生物学の必須なツールとなっている。なかでも、生物発光を触媒する最小酵素であるガウシア由来のルシフェラーゼ(以下、GLuc)への期待は大きい。しかし、システインを多数有するGLucは、非天然型SS結合を形成して凝集しやすいため、その生成は困難である。そのため、GLucの機能解析及び改変がほとんど進められておらず、バイオイメージングへの応用はまだ限られている。本研究では、独自に開発したSEPタグ技術(溶解性向上タグ)を用いることで、天然型SS結合を形成するGLucの汎用的な発現精製系を構築し、その機能と物性を解析、発光極大波長をレッドシフトしたGLuc変異体をランダムスクリーニングによって構築した。

研究成果

• [雑誌論文] Probing the physical determinants of thermal expansion of folded proteins (2013)
  • 著者名/発表者名: Dellarole M, Kobayashi K, Rouget JB, Caro A, Roche J, Islam MM,Garcia-Moreno BE, Kuroda Y, Royer CA
  • 雑誌名: J Phys Chem B 巻: (in press)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Extraction of recombinantprotein from E.coli by using a novel cell autolysis activity of VanX (2013)
  • 著者名/発表者名: Kamioka T, Sohya S, Wu N, Maki T, Matsuda T, Ikegami T, Nakamura H, Kuroda Y
  • 雑誌名: Analytical Biochemistry 巻: (in press)
  • DOI: doi:10.1016/j.ab.2013.04.007
  • 査読あり
• [雑誌論文] High resolution crystal structure of dengue-3 envelope protein domain III suggests possible molecular mechanisms for serospecific antibody recognition (2013)
  • 著者名/発表者名: Elahi M, Islam M M, Noguchi K, Yohda M, Kuroda Y
  • 雑誌名: Proteins 巻: 81(6) ページ: 1090-1095
  • DOI: DOI:10.1002/prot.24237
  • 査読あり
• [雑誌論文] Experimental identification and theoretical analysis of a thermallystabilized green fluorescent protein variant (2012)
  • 著者名/発表者名: Akiyama S, Suenaga A, Kobayashi T, Kamioka T, Taiji M, Kuroda Y
  • 雑誌名: Biochemistry 巻: 51(40) ページ: 7974-7982
  • DOI: doi:10.1021/bi300580j
  • 査読あり
• [雑誌論文] Analysis of amino acid contributions to protein solubility using short peptide tags fused to a simplified BPTI variant (2012)
  • 著者名/発表者名: Islam M M, Khan M M A, Kuroda Y
  • 雑誌名: BBA Proteins and Proteomics 巻: 1824(10) ページ: 1144-1150
  • DOI: DOI:10.1016/j.bbapap.2012.06.005
  • 査読あり
• [雑誌論文] Solubilization and folding of a fully active recombinant Gaussialuciferase with native disulfide bonds by using a SEP-tag (2011)
  • 著者名/発表者名: Rathnayaka T, Tawa M, Nakamura T, Sohya S, Kuwajima K, Yohda M, Kuroda Y
  • 雑誌名: BBA Proteins and Proteomics 巻: 1814(12) ページ: 1775-1778
  • DOI: DOI:10.1016/j.bbapap.2011.09.001
  • 査読あり
• [雑誌論文] VanXの溶菌活性の解明と菌体内生産物の精製工程の簡略化 (2011)
  • 著者名/発表者名: 黒田裕、上岡哲矢、惣谷志保里
  • 雑誌名: 未来材料 巻: 11(7) ページ: 32-36
• [学会発表] ガウシアルシフェラーゼのスクリーニングによる改変 (2013)
  • 著者名/発表者名: Wu Nan,上岡哲矢,黒田裕
  • 学会等名: 生物物理関東地区研究会
  • 発表場所: 東京農工大学工学部(東京都)
  • 年月日: 2013-03-04
• [学会発表] 黒田裕,多数ペプチド系の全原子分子動力学シミュレーションを用いた凝集の解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 佐藤雄士,末永敦,秋山沙織
  • 学会等名: 生物物理関東地区研究会
  • 発表場所: 東京農工大学工学部(東京都)
  • 年月日: 2013-03-04
• [学会発表] サポートベクターマシン(SVM)を用いたヘリカルリンカー領域の予測 (2013)
  • 著者名/発表者名: 鈴木涼祐,蝦名鉄平,黒田裕
  • 学会等名: 生物物理関東地区研究会
  • 発表場所: 東京農工大学工学部(東京都)
  • 年月日: 2013-03-04
• [学会発表] システインを含むタグ配列と溶解性向上タグ配列の挿入によるGLucリフォールディングへの影響 (2013)
  • 著者名/発表者名: 鈴木郁也,今井清博,黒田裕
  • 学会等名: 生物物理関東地区研究会
  • 発表場所: 東京農工大学工学部(東京都)
  • 年月日: 2013-03-04
• [学会発表] VanXの溶菌活性を用いたルシフェラーゼのス クリーニングの簡略化 (2012)
  • 著者名/発表者名: Wu Nan, Tetsuya Kamioka, Shihori Sohya, Tomoki Matsuda, Takahisa Ikegami, Haruki Nakamura, Yutaka Kuroda
  • 学会等名: 第50回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 名古屋大学・東山キャンパス(愛知県)
  • 年月日: 20120922-24
• [学会発表] 単純化BPTI に融合したペプ チド系タグ配列を用いたアミノ酸溶解性の測定 (2012)
  • 著者名/発表者名: Yutaka Kuroda, Alam, M. Khan, Mohammad, M. Islam
  • 学会等名: 第50回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 名古屋大学・東山キャンパス(愛知県)
  • 年月日: 20120922-24
• [学会発表] 独立してフォールドする構造ドメインデータベースの構築 (2012)
  • 著者名/発表者名: Yuki Umezawa, Teppei Ebina, Yutaka Kuroda
  • 学会等名: 第50回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 名古屋大学・東山キャンパス(愛知県)
  • 年月日: 20120922-24
• [学会発表] Effects of short solubility controlling peptide tags on protein's solubility, thermodynamics, structure and function (2012)
  • 著者名/発表者名: Mohammad M Islam, Yutaka Kuroda
  • 学会等名: Conference of the Bangladesh Society for Biochemistry and Molecular Biology
  • 発表場所: University of Rajshahi(Rajshahi, Bangladesh)
  • 年月日: 20120225-26
• [学会発表] Biophysical Analysis of Protein Aggregation Kinetics Based on a Monomer-Oligomer Model (2012)
  • 著者名/発表者名: Yutaka Kuroda, Alam M. Khan, Monirul M Islam
  • 学会等名: 新学術領域研 究「揺らぎと生体機能」第6回公開シンポジウム
  • 発表場所: 京都テルサ(京都府)
  • 年月日: 2012-12-05
• [学会発表] カン・A・モンシュール,イスラム・M・モニール,単純化BPTIとペプチド系タグを用いたアミノ酸溶解性の時間的変化・揺らぎの解析 (2012)
  • 著者名/発表者名: 黒田裕
  • 学会等名: 新学術領域「揺らぎと生体機能」「水和とATP」合同公開シンポジウム
  • 発表場所: 大阪ガーデンパレス(大阪府)(招待講演)
  • 年月日: 2012-09-14
• [学会発表] カンMモハメド,イスラムMモハマド,単純化BPTIタンパク質に融合した短いペプチド系タグを用いたアミノ酸溶解性の解析 (2012)
  • 著者名/発表者名: 黒田裕
  • 学会等名: 第12回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: 名古屋国際会議場(愛知県)
  • 年月日: 2012-06-22
• [学会発表] Two serotypes of dengue viruses show specific local structural difference in their crystal structures of envelope protein domain III(ED3) (2012)
  • 著者名/発表者名: Montasir Elahi, M. Monirul Islam, Keiichi Noguchi, Masafumi Yohda,Yutaka Kuroda
  • 学会等名: 第12回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: 名古屋国際会議場(愛知県)
  • 年月日: 2012-06-21
• [学会発表] VanXの大腸菌溶菌活性を利用した新規スクリーニング技術の開発 (2012)
  • 著者名/発表者名: Wu Nan,上岡哲矢,黒田裕
  • 学会等名: 生物物理関東地区研究会
  • 発表場所: 東京農工大学工学部(東京都)
  • 年月日: 2012-03-05
• [学会発表] 構造ドメインデータベースの作成およびそのWeb提供 (2012)
  • 著者名/発表者名: 梅澤祐貴,蝦名鉄平,黒田裕
  • 学会等名: 生物物理関東地区研究会
  • 発表場所: 東京農工大学工学部(東京都)
  • 年月日: 2012-03-05
• [学会発表] Masafumi Yohda, Yutaka Kuroda, High resolution Crystal structure of Dengue 3 envelope protein domain III (ED3) (2012)
  • 著者名/発表者名: Montasir Elahi, Mohammad M Islam, Keiichi Noguchi
  • 学会等名: 生物物理関東地区研究会
  • 発表場所: 東京農工大学工学部(東京都)
  • 年月日: 2012-03-05
• [学会発表] Contribution of individual amino acids to proteinsolubility using amino acid tag (2012)
  • 著者名/発表者名: Mohammed M. A. Khan, Mohammad M. Islam, Yutaka Kuroda
  • 学会等名: 生物物理関東地区研究会
  • 発表場所: 東京農工大学工学部(東京都)
  • 年月日: 2012-03-05
• [学会発表] Host Guest Analysis of Amino Acids contribution to Protein Solubility Using Short SET-Tags Fused to aSimplified BPTI (2012)
  • 著者名/発表者名: Mohammad M. Islam, Yutaka Kuroda
  • 学会等名: 揺らぎが機能を決める生命分子の科学第5回公開シンポジウム
  • 発表場所: 東大寺文化センター(奈良県)(招待講演)
  • 年月日: 2012-01-07
• [学会発表] VanXの大腸菌溶菌機構を利用した新規スクリーニング法の開発 (2011)
  • 著者名/発表者名: Wu Nan,上岡哲矢,惣谷志保里,黒田裕
  • 学会等名: 第34回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜(神奈川県)
  • 年月日: 20111214-15
• [学会発表] Crystal structure of Dengue 3 envelope protein domain III (2011)
  • 著者名/発表者名: Montasir Elahi,Mohammad Monirul Islam, Keiichi Noguchi, Masafumi Yohda , Yutaka Kuroda
  • 学会等名: 第34回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜(神奈川県)
  • 年月日: 2011-12-14
• [学会発表] Catherine A. Royer, Understanding protein native expansivity by mutants affecting cavities, surface and order (2011)
  • 著者名/発表者名: Jean-Baptiste Rouget, Mariano Dellarole, Kei Kobayashi, Julien Roche, Yutaka Kuroda
  • 学会等名: 6^th International Meeting on Biomolecules under Pressure (IMBP2011)
  • 発表場所: 大津市市民会館(滋賀県)
  • 年月日: 2011-12-13
• [学会発表] Contribution of individual amino acidto protein solubility using amino acid tag (2011)
  • 著者名/発表者名: Mohammed Monsur Alam Khan , Mohammad Monirul Islam , Yutaka Kuroda
  • 学会等名: 第34回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜(神奈川県)
  • 年月日: 2011-12-13
• [学会発表] 難結晶化タンパク質変異体に対するヘテロシーディング法 (2011)
  • 著者名/発表者名: 小林慶,Mohammad Islam,野口恵一,養王田正文,黒田裕
  • 学会等名: 第11回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: 阪急エキスポパーク(大阪府)
  • 年月日: 2011-06-07
• [学会発表] ヘリックスを含むドメイン境界配列の解析及びその予測 (2011)
  • 著者名/発表者名: 辻良太郎,蝦名鉄平,黒田裕
  • 学会等名: 第11回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: 阪急エキスポパーク(大阪府)
  • 年月日: 2011-06-07
• [学会発表] Amino Acids Contribution to Polypeptides Solubility Analyzed Using Short Poly-Amino Acid Tags (2011)
  • 著者名/発表者名: Yutaka Kuroda, Atsushi Kato, Mohammad Islam
  • 学会等名: 第11回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: 阪急エキスポパーク(大阪府)
  • 年月日: 2011-06-07
• [学会発表] Effects of short solubility controlling peptide tags on protein solubility, thermodynamics, structure and function (2011)
  • 著者名/発表者名: Mohammad M Islam, Atsushi Kato, Shihori Sohya, Mohammed Khan,Keiichi Noguchi, Masafumi Yohda, Shun-ichi Kidokoro, Yutaka Kuroda
  • 学会等名: 第11回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: 阪急エキスポパーク(大阪府)
  • 年月日: 2011-06-07
• [学会発表] 蛋白質異常凝集の原理と制御 (2011)
  • 著者名/発表者名: 黒田裕,八木寿梓,長谷川一浩,青島貞人,佐崎元
  • 学会等名: 大阪大学蛋白質研究所セミナー
  • 発表場所: 阪大吹田キャンパス(大阪府)(招待講演)
  • 年月日: 2011-04-27
• [備考]
  • URL: http://www.tuat.ac.jp/~ykuroda