| 研究課題/領域番号 |
23651248
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| 研究機関 | 立命館大学 |
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研究代表者 |
高田 達之 立命館大学, 薬学部, 教授 (90206756)
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| キーワード | 固有魚 / 精子分化 / 生殖細胞 / ホルモンセンサー |
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| 研究概要 |
ホンモロコの受精卵由来細胞株の特性解析および培養条件の検討を行った。その結果、受精卵で高い発現を示すOct4(Pou2), nanog, sox2, klf4は発現していないが正常な染色体数を維持していること、また様々な核レセプターを発現していることが明らかとなった。本研究で樹立した細胞株がエストロジェン、アンドロジェン、プロジェステロン、グルココルチコイド受容体を発現していることから、セルトリ細胞由来細胞にMMTV/pGL4.36 ベクターを導入し、内在性の核内レセプターを用いたアンドロジェン、プロジェステロン検出系を構築した。その結果、本細胞株は魚類特有のアンドロジェン,11KTおよびプロジェステロン,DHPに特異的、濃度依存的に反応するが、テストステロンには反応しないこと、内分泌攪乱作用を持つとされるノニルフェノールが、琵琶湖固有種ホンモロコのセルトリ細胞に対して抗アンドロジェン作用を持つこと、またビスフェノールAがアンドロジェン様作用を有することが明らかとなった。これらの結果は、本細胞株が固有種特有のホルモン応答、内分泌攪乱作用を検出するテーラーメードバイオセンサーとして利用可能であることを示唆した。
次にホンモロコにおける精子のin vitro分化系の確立を目的とし、繁殖期、非繁殖期の成魚精巣に加え、稚魚精巣を用いてin vitro分化実験を行い、運動能を有した精子分化に成功した。フローサイトメトリー解析により、１倍体精子の形成が確認されたことからin vitroで減数分裂が正常に進行していると考えられた。
また、ゼブラフィッシュ受精卵由来の初代培養細胞を用い、ヒトOct4,Sox2, Klf4,c-Myc遺伝子をエレクトロポレーションにより導入し、iPS細胞の樹立実験を試みたところ、アルカリフォスファターゼ弱陽性コロニーの形成が認められた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
繁殖期から非繁殖期に至る様々な時期の精巣、卵巣、受精卵において細胞株樹立に成功した。
また、ホンモロコ精巣、卵巣、受精卵由来細胞株がエストロジェン、アンドロジェン、プロジェステロン、グルココルチコイド受容体を発現していることを見出し、MMTV/pGL4.36ベクターを導入し、内在性の核内レセプターを用いたアンドロジェン、プロジェステロン検出系を構築した。その結果、テストステロンには反応せず、魚類特有のアンドロジェン,11KTに反応することが示され、固有種のホルモン応答解析に有用であることが示された。さらに、ノニルフェノールが、琵琶湖固有種ホンモロコのセルトリ細胞に対して抗アンドロジェン作用を持つこと、またビスフェノールAがアンドロジェン様作用を有することを見いだした。
稚魚精巣からもin vitro精子分化が可能であることを示すと共に、ヒト由来Oct4,Sox2, Klf4,c-Myc遺伝子導入実験を行った。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．精原細胞培養、in vitro精子受精能
樹立した繁殖期、非繁殖期、受精卵由来細胞株をフィーダー細胞として用い、精原細胞の維持培養、生殖細胞株の樹立を試みる。
２．in vitro分化系により作製した精子の受性能を確認し、機能的な精子がin vitroで作製可能であることを示す。
３．ホンモロコiPS細胞の樹立
エピソーマルベクターを使用し、Oct4,Sox2, Klf4,c-Mycを導入し、固有魚種、ホンモロコの細胞を用いてiPS細胞の樹立実験を行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
25年度に繁殖期、非繁殖期の成魚精巣由来細胞を用い、in vitro分化により形成した精子と固有種成熟卵による人工授精実験を行う予定であったが、共同研究先の人事異動等の事情により、成魚、成熟卵の入手が予定通り行えず、未使用額が生じた。繁殖は年１回の季節繁殖のため、次年度に当該実験を行うこととした。
主に固有種、ホンモロコ成魚、細胞培養に必要な培養液、血清、増殖因子、プラスチック製品、およびプラスミド精製、遺伝子導入に必要な試薬、キットの購入に使用する予定である。
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