研究課題
生物の保全においては配偶子等細胞の凍結保存法の開発が必要となる。そこで精原細胞の凍結保存を試みたところ、ガラス化冷却法を用いることにより、精原細胞を効率良く保存できることがわかった。さらに精原細胞培養、およびin vitro精子分化に関して、培養条件の至適化を試み、体細胞の増殖を抑制する事により、効率良く精子分化が進行し、天然の精子を用いた時とほぼ同等の受精率を得る条件を見いだす事ができた。次にin vitro 分化により得られた精子の配偶子としての機能を確認するため、人工授精実験を行った。その結果、非繁殖期精巣から採取した生殖細胞を分化させて得られた精子が実際に受精能を有することが示された。すなわち本研究で確立した精原細胞のin vitro 分化により、機能的な精子を形成できることが明らかとなった。さらに他魚種の未受精卵を使用することにより、受精能の検証が可能であることも示した。また、精原細胞培養、および精子分化培養において、核DNAのPI染色とvasa抗体染色を併用し、フローサイトメトリーにより、体細胞と生殖細胞、さらに精原細胞、精母細胞、精子を区別して定量出来る分析系を確立した。iPS細胞樹立実験においては、ホンモロコ受精卵由来細胞からは、iPS細胞様のコロニーは検出されなかった。一方、ゼブラフィッシュ細胞から、弱いアルカリフォスファターゼ活性、vasaを発現するコロニー形成が認められたがOct4, Nanog等多能性マーカーの発現は、認められなかった。以上本研究により、琵琶湖固有種において、精原細胞の凍結保存と、in vitro精子分化系を組み合わせ、受精能を有する精子を作製する新規の保存方法を確立する事ができた。この方法は従来の精子保存の代替法となるのみならず、季節繁殖性の野生固有種における雄性生殖資源の保存方法として有用であると考えられる。
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In Vitro Cell Dev Biol Anim.
巻: in press ページ: in press
10.1007/s11626-015-9894-y
J. Toxicol. Sci.
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http://www.ritsumei.ac.jp/research/r-giro/projects/environment/biosensor.html/
