• 研究課題をさがす
  • 研究者をさがす
  • KAKENの使い方
  1. 課題ページに戻る

2011 年度 実施状況報告書

新規タンパク質発現抑制法ドメイン干渉によるヒトPDI及びsEHの機能解析

研究課題

研究課題/領域番号 23655162
研究機関関西学院大学

研究代表者

今岡 進  関西学院大学, 理工学部, 教授 (60145795)

研究期間 (年度) 2011-04-28 – 2013-03-31
キーワードドメイン干渉 / PDI / sEH / HEK293 / GH3
研究概要

当該研究は、ドメイン干渉を哺乳動物に応用する試みである。ドメイン干渉とは、大腸菌中のあるタンパク質のドメインを過剰発現させると、大腸菌の中で生合成されつつあるそのタンパク質が、このドメインと相互作用することで、それ以上翻訳されなかったり、あるいはうまくフォールディングされないことで、分解が促進される新しいタンパク質発現抑制機構である。このような反応が哺乳動物で起こるかどうか、全く不明である。そこで、このターゲットタンパク質として、当研究室で現在機能解析が進行中であるプロテインジスルヒドイソメラーゼ(PDI)と可溶性エポキシドヒドロラーゼ(sEH)を材料にして検討を行った。まず、PDIについて検討した。PDIはa,b,b’, a’ドメインから成り、すでに、b’とa’が相互作用することを明らかにしている。そして、a’はイソメラーゼ活性中心を有しているが。b’とa’との相互作用によってa’の活性が増強することを明らかにしている。そこで、bとb’をラット脳下垂体GH3細胞に過剰発現してPDIの発現量の変化を検討したが、bは過剰発現されるものの、b’には十分な過剰発現がなく、その影響を明らかにするには至らなかった。 そこで、大腸菌で二つのタンパク質を同時に発現する系を構築して、PDIとbまたはb’を過剰発現してPDIの発現量を検討している。一方、sEHはホスファターゼ活性を持つN-末端ドメインとエポキシドヒドロラーゼ活性を持つC-末端ドメインがあり、2個のタンパク質がそれぞれのドメインで相互作用し、二両体を形成して安定化していると考えられている。ヒト肝がん細胞Hep3Bに、sEHのN-末端またはC-末端ドメインを過剰発現すると常在しているsEHの発現の低下がみられ、ほ乳細胞でもドメイン干渉が起こる可能性が示された。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究では、大腸菌で見いだされたドメイン干渉(ドメイン同士が相互作用することで、タンパク質の発現が低下する現象)が、哺乳動物でも起こるかどうか、さらには起こす条件やタンパク質の種類を明らかにし、哺乳動物における、一般的なタンパク質発現抑制法に発展させることを目的とする。当該研究では代表者がターゲットとしているタンパク質で、ドメイン構造がしっかりしており、ドメイン同士の相互作用も明らかにしているプロテインジスルヒドイソメラーゼ(PDI)と可溶性エポキシドヒドロラーゼ(sEH)を材料にして検討を行った。まず、PDIについて検討した。PDIはa,b,b’, a’ドメインから成り、すでに、b’とa’が相互作用することを明らかにしている。細胞で発現できる様々なドメインコンストラクトを作成し、ラット脳下垂体細胞GH3で発現した。ほとんどの作成したドメインは細胞での発現が成功した。しかしもっとも重要であるb’ドメインが発現されなかった。この原因については現在検討中であり、これ以上の研究は進められない状況にある。一方、sEHはホスファターゼ活性を持つN-末端ドメインとエポキシドヒドロラーゼ活性を持つC-末端ドメインがあり、2個のタンパク質がそれぞれのドメインで相互作用し、二両体を形成して安定化していると考えられている。ヒト肝がん細胞Hep3Bに、sEHのN-末端またはC-末端ドメインを過剰発現すると常在しているsEHの発現の低下がみられ、哺乳細胞でもドメイン干渉が起こる可能性が示された。さらに、今後この機構を解明したいと考えている。さらに、ドメイン干渉は元々大腸菌で見いだされたことから、大腸菌で二種類のタンパク質を発現する系を構築した。たとえばこの系で、PDIと様々なドメインを動じ発現して、それぞれの発現量を検討する予定である。

今後の研究の推進方策

本研究では、大腸菌を用いて完成されたドメイン干渉を哺乳動物で検討すべく以下の実験1~3について検討を行う。大腸菌におけるドメイン干渉実験においてタンパク質の種類によって発現が抑制できるものとできないものがある。これはおそらくドメイン構造及びそのドメイン同士の相互作用の違いによると考えられる。そこで、ヒトのタンパク質においてもその条件に当てはまるものを探す必要があるため、以下に具体的な実験計画を示す。1.大腸菌を用いた検討これまでの検討で大腸菌を用いて、二種類のタンパク質またはペプチドを発現する系を確立したので以下のほ乳細胞と同様の検討を行う。2.PDIについてほ乳細胞での検討PDIファミリータンパク質のうち、PDI, ERp57, ERp72はドメイン構造が特に類似しているので、これらの各ドメイン変異体を作成し細胞に導入し、元々のタンパク質の発現量が変化するかどうかを検討する。先に述べたようにPDIについては、様々なドメイン変異体を作成しているが、重要と思われるb’ドメインの発現はうまくいっていない。そこで、ERp57, ERp72についてもPDIと同様に、大腸菌で発現系を用いて検討するとともに、ドメインを細胞に導入して、元々のタンパク質の発現量変化を調べる。ドメイン干渉が成功すれば、そのドメインの相互作用等を詳しく検討してそのメカニズムを解明する。3.sEHについての検討ドメインを大腸菌で発現精製して、ドメイン間の相互作用を明らかにする。なお、ドメイン間の相互作用については、代表者はBiacore(表面プラズモン共鳴)を使用する方法やネイティブ電気泳動をする方法を確立している。

次年度の研究費の使用計画

研究代表者が年度途中で療養のため入院したため、年度の後半は当初予定していた実験規模を縮小して研究を進めたことから、当初の予定よりも試薬などの物品購入が少額であり、未使用額が発生した。これについては、平成24年度の使用計画と併せて上述の今後の研究の推進で述べた計画を実施するために、細部培養のための試薬、コンストラクト作成を確認するためのDNAシークエンス用の試薬、Biacoore用のチップの購入に使用する。

  • 研究成果

    (7件)

すべて 2012 2011

すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 4件) 学会発表 (3件)

  • [雑誌論文] Crystallization and preliminary crystallographic analysis of the complex between triiodothyronine and the bb' fragment of rat protein disulfide isomerase.2012

    • 著者名/発表者名
      Hashimoto S, Ito L, Okumura M, Shibano T, Nawata M, Kumasaka T, Yamaguchi H, and Imaoka S.
    • 雑誌名

      Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun.

      巻: 68(Pt4) ページ: 476-478

    • DOI

      doi:10.1107/S1744309112007439

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Lysophosphatidic acids are new substrates for the phosphatase domain of soluble epoxide hydrolase.2012

    • 著者名/発表者名
      Oguro A and Imaoka S.
    • 雑誌名

      J. Lipid. Res.

      巻: 53 ページ: 505-512

    • DOI

      doi:10.1194/jlr.M022319

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Effects of Polybrominated Diphenyl Ethers (PBDEs) and Their Derivatives on Protein Disulfide Isomerase Activity and Growth Hormone Release of GH3 Cells.2012

    • 著者名/発表者名
      Imaoka S and Hashimoto S
    • 雑誌名

      Chem. Res. Toxicol.

      巻: 25 ページ: 656-663

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Chemical stress on protein disulfide isomerases and inhibition of their functions.2011

    • 著者名/発表者名
      Imaoka S
    • 雑誌名

      Int. Rev. Cell Mol. Biol.

      巻: 290 ページ: 121-166

    • DOI

      doi:10.1016/B978-0-12-386037-8

    • 査読あり
  • [学会発表] Structural changes of protein disulfide isomerase by the binding of bisphenol A2011

    • 著者名/発表者名
      Hashimoto S, Shiomoto K, Okada K, and Imaoka S
    • 学会等名
      ESF-EMBO Symposum: Glutathione and Related Thils in Living Cells
    • 発表場所
      Sant Feliu de Guixols,スペイン
    • 年月日
      2011.9.5
  • [学会発表] Contribution of epoxyeicosatrienoic acids (EETs) to hypoxic response of cells.2011

    • 著者名/発表者名
      Imaoka S, Oguro A, and Suzuki S
    • 学会等名
      52nd International Conference on the Bioscince of Lipids
    • 発表場所
      Warsaw,ポーランド
    • 年月日
      2011.8.30
  • [学会発表] Proliferation of cancer cells is mediated by EET production.2011

    • 著者名/発表者名
      Oguro A, Sakamoto K, and Imaoka S
    • 学会等名
      52nd International Conference on the Bioscience of Lipids
    • 発表場所
      Warsaw,ポーランド
    • 年月日
      2011.8.30

URL: 

公開日: 2013-07-10  

サービス概要 検索マニュアル よくある質問 お知らせ 利用規程 科研費による研究の帰属

Powered by NII kakenhi