研究課題
DNAメチル化やヒストン修飾などを介した遺伝子配列変化を伴わない遺伝子発現制御機構であるエピジェネティクスは、近年大きな注目を浴びる研究分野である。本研究では、形質膜を透過性にした「セミインタクト細胞系」とその「リシール細胞技術」を駆使して、糖尿病態細胞質環境下におけるエピジェネティクス改変の可視化およびその分子メカニズム解明を目指すものである。前年度までに、メチル化DNA結合タンパク質MeCP2のGFP融合タンパク質（MeCP2-GFP）発現細胞の形質膜に穴をあけ（セミインタクトにし）、ここに糖尿病モデルマウスdb/dbマウスの肝臓細胞質を導入することにより、MeCP2-GFPが核内で分散することを見いだしている。このことは細胞内環境を糖尿病肝臓状態へと改変された「糖尿病モデル細胞」では、ゲノムDNAメチル化状態に変化があることを示唆している。本年度は酵母ツーハイブリッド法でMeCP2結合タンパク質を探索することにより、糖尿病モデル細胞でのMeCP2-GFP動態変化のメカニズム解明を目指していた。しかし、いくつかのMeCP2結合候補タンパク質を同定することができたものの、細胞内でのMeCP2との結合能やその機能解析の実験結果はネガティブなものであった。そこで現在、構築した糖尿病モデル細胞のマイクロアレイ解析を行い、糖尿病モデル細胞中で特異的に発現変動する遺伝子群を抽出しており、その中から糖尿病細胞質依存的にエピジェネティクス改変されうる遺伝子群の絞り込みやエピジェネティクス改変因子の抽出および機能解析を進めている。
3: やや遅れている
理由の一つは、前年度に行う予定であったアッセイ系の構築およびMeCP2動態測定の定量性の問題をクリアするために時間がかかり、結果的に次年度の計画も後ろにずれざるを得ない状況であるためであった。さらに、酵母ツーハイブリッド法によりMeCP2結合候補タンパク質を得たものの、それ以降の実験のMeCP2との結合能の確認などに予想以上の時間がかかったことも達成度の遅れを生じさせることとなった。その一方で、糖尿病モデル細胞で特異的に発現変動する遺伝子群のマイクレアレイ解析は順調に進んでおり、野生型マウス肝臓細胞質を導入した「正常モデル細胞」と糖尿病肝臓細胞質を導入した「糖尿病モデル細胞」との遺伝子発現を比較したところ、細胞質導入後２時間以内という短時間のインキュベーションで糖尿病細胞質依存的に発現変動する遺伝子群を複数得ることができた。現在はこれらの遺伝子群と糖尿病モデル細胞におけるエピジェネティクス改変との関与を明らかにすべく実験を進めている。
マイクロアレイ解析によって同定された糖尿病モデル細胞で特異的に発現変動する遺伝子について、糖尿病モデル細胞におけるエピジェネティクス変化への関与を検証する。具体的には、マイクロアレイ解析で同定された遺伝子プロモーターのDNAメチル化状態を、bisulfide法やメチル化感受性酵素法などにより調べ、糖尿病肝臓細胞質導入によるDNAメチル化への影響を検証する。また、マイクロアレイ解析で抽出された遺伝子の中にはエピジェネティクス改変を誘導しうる因子も見つかっている。これらの遺伝子は糖尿病モデル細胞で確認されたMeCP2-GFP動態攪乱に関与する可能性があり、ひいては糖尿病態におけるエピジェネティクス改変の鍵因子となりうる。そこで、当該遺伝子の糖尿病モデル細胞におけるエピジェネティクス改変とのつながりを検証する。具体的には、まず、正常・糖尿病モデル細胞における当該遺伝子の発現をwestern blottingや定量的PCRにより確認した上で、前年度までに構築した細胞系を利用し、糖尿病細胞質依存的なMeCP2分散化への関与を抗体やドミナントネガティブリコンビナントタンパク質添加など生化学的方法を駆使し検証する。
次年度では、マイクロアレイ解析により同定された因子の機能解析を中心に行うため、RNA抽出、定量的PCR、クローニング、トランスフェクションといった分子生物学的実験用試薬、western blottingやリコンビナントタンパク質調製といった生化学的実験用試薬、細胞培養関連試薬・器具などに研究費を使用する予定である。また、研究打ち合わせや学会での研究成果発表のための旅費や、論文作成時の英文校正費も計上した。
すべて 2012
すべて 雑誌論文 (5件) (うち査読あり 2件) 学会発表 (1件) (うち招待講演 1件)
PLoS ONE
巻: 7 ページ: e44127
10.1371/journal.pone.0044127
Biochem. Biophys. Acta (Molecular Cell Research)
巻: 1823 ページ: 861-875
生体の科学
巻: 63 ページ: 404-407
巻: 63 ページ: 424-425
化学と生物
巻: 50 ページ: 510-517
