| 研究課題/領域番号 |
23657052
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| 研究機関 | 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(共通施設) |
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研究代表者 |
椎名 伸之 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(共通施設), 岡崎統合バイオサイエンスセンタ―, 准教授 (30332175)
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| 研究期間 (年度) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| キーワード | RhoファミリーGEF / チャネルロドプシン / シナプス |
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| 研究概要 |
RhoファミリーのGEFを光刺激依存的に膜へ移行させ、RhoファミリーGTPaseを活性化するためのコンストラクトを作製した。また、これらを培養細胞に導入した。実際に用いたGEFは、RacGEFのTiam、Cdc42GEFのintersectin、RhoGEFのTimで、これらにmYFPとPIF6を融合した。これらGEF-mYFP-PIF6をPhyB-mCherry-CAAXとともに培養細胞であるA6にとランスフェクションした。PCB存在下、650 nmの光照射でPIF6とPhyBの結合を誘導できることから、GEFの膜移行を促進することができる。ステーブルトランスフェクタントを得るための薬剤スクリーニングをおこなったが、ステーブルトランスフェクタントを得ることはできなかった。その理由として、膜移行を促進しない状態でも、ベーサルレベルのGEF活性が上昇していることが考えられる。実際、ラメリポディアの形成を促進することが知られているTiamのコンストラクトを導入した細胞は、導入していない細胞に比べて培養ディッシュに強く張り付いて扁平な形態になっていた。今後は、トランジェントトランスフェクタントで実験をおこなう必要があると考えられた。 また、青色光によって細胞内にNa+等のカチオンを流入させるチャネルロドプシンをマウス脳神経初代培養細胞に導入した。この神経細胞を光照射することにより、樹状突起における局所的翻訳を活性化できることを明らかにした。局所的翻訳はシナプス長期増強刺激によって活性化されることが知られており、今後、チャネルロドプシンの活性化がシナプスの形態変化を引き起こしているかどうかについて解析をおこなう。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
RhoファミリーGEFのコンストラクトが細胞に発現されて機能しうること、チャネルロドプシンが神経初代培養細胞に発現されて局所的翻訳を引き起こしうることがわかり、今後のシナプス形態観察のための道筋をつけることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
RhoファミリーGEFについて、トランジェントトランスフェクタントでの効果を解析するとともに、神経培養細胞に発現し、シナプス形態への効果を解析する。また、チャネルロドプシンについては、神経初代培養細胞で局所的翻訳への効果が見られたことから、今後はシナプス形態への効果を解析していく。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
今年度は、既存の試薬や器具を使用することができたため、当該研究費が生じた。次年度は主に実験動物、培養器具と培地、試薬に研究費を使用する。
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