| 研究課題/領域番号 |
23657080
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| 研究機関 | 兵庫県立大学 |
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研究代表者 |
水島 恒裕 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (90362269)
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| 研究期間 (年度) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| キーワード | プロテアソーム / 超分子複合体 / シャペロン / X線結晶構造解析 / 構造生物学 |
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| 研究概要 |
26Sプロテアソームを構成する20Sプロテアソームは14種類(α1-α7, β1-β7)、28個のサブユニットが複合体を形成することにより、機能を獲得している。この複合体形成過程には複数の専用シャペロンが関わっていることから、これら専用シャペロンを利用することにより試験管内において20Sプロテアソームαリング(α1-α7)の再構成を行った。20Sプロテアソームは可溶性タグ融合状態で精製した。この時、α6サブユニットは不溶性となったことから、FATTタグ融合タンパク質として精製を行った。また、20Sプロテアソーム複合体形成に関わる専用シャペロンとしてPba1-Pba2複合体、Pba3-Pba4複合体を大腸菌発現系より精製した。 精製した各構成サブユニットおよび専用シャペロンのゲルろ過クロマトグラフィーを行い、単独状態における分子状態、凝集性を確認した。その結果、サブユニット単独状態ではα4、α7は多量体、α5はホモ二量体を形成していることが明らかとなった。α5は専用シャペロンPba3-Pba4複合体が共存することによりα5- Pba3-Pba4のヘテロ三量体を形成した。また、α1-α7の7種類のサブユニットのみで行ったゲルろ過クロマトグラフィーではほとんどのサブユニットが単独状態で行ったゲルろ過クロマトグラフィーと同様の時間で溶出されαリングの形成は確認できなかった。次にα1-α7の7サブユニットにPba1-Pba2複合体、Pba3-Pba4複合体を加えてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。しかし、これら専用シャペロンの共存状態においてもαリングの形成は確認できず、一部のサブユニットとシャペロンの複合体による中間体状態のみが観測できた。このことから、αリング中間体は不安定であることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
酵母20Sプロテアソームおよび専用シャペロンの大腸菌発現系構築が完了し、それらを用いた試験管内構築を行った。さらにゲルろ過クロマトグラフィーによりαリング形成中間体の分離を行い、中間体を形成するサブユニットの解析を行った。これらの成果は当初計画通りである。
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| 今後の研究の推進方策 |
試験管内におけるプロテアソームαリング構築研究より、αサブユニットと専用シャペロンのみで形成されるαリングは不安定であることが示唆された。そのため、βサブユニット、βリング形成シャペロン(Ump1)を加えた試験管内複合体再構築を行う。本実験により7種類のβサブユニット中、αリングの形成に関わるβサブユニットを特定する。また、βサブユニット存在状態において形成される中間体の解析を行い、より詳細な複合体形成機構の解析を行う。さらに、αリング形成に必要な専用シャペロンが他に存在するか探索を行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
２４年度の研究計画では、20Sプロテアソームを形成する全14種類のサブユニットを用いて再構成実験を行う。そのため、各サブユニットタンパク質の培養、精製に使用する試薬を購入する。また、研究成果を学会発表するための旅費を申請する。
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