研究課題
細胞内で停止したDNA複製フォークの安定化を促進する新規技術を開発するために、停止フォークを特異的に検出する方法を確立する必要がある。大腸菌PriAタンパク質は、停止フォーク構造を特異的に認識して結合する能力を有する。このタンパク質は、細胞内でも停止したフォークに特異的に結合している可能性が示唆されるので、この結合を検出することで、生体内でのフォーク停止の認識及び安定化が可能であろう。特異的検出方法確立のために、ChIP-on-chipによる解析を試みたところ、チミン枯渇処理によりフォークを停止させると、複製起点oriC付近に大きなピークのクラスターを見出した。この事は、PriAが細胞内で停止したフォーク構造に実際に結合し、チミン枯渇はoriC付近に停止フォークを蓄積させる可能性を示唆する。一方、oriCに依存せずに複製するrnhA株で同様の実験を行なったところterC終結領域にPriAは結合した。この事はterC領域にoriCに依存しない二次的複製起点があることを示唆する。実際rnhA株においてterCを欠損すると生育能力が著しく低下した。以上の結果は、PriAタンパク質を特異的に追跡することにより、ゲノム上でフォークが停止しやすい領域（染色体脆弱部位）を検出したり、PriAにより停止フォークを安定化できるかどうかを視覚化するための有用なツールとして利用できる可能性を強く示唆する。現在PriAを真核細胞(分裂酵母と動物細胞)で発現し停止複製フォークの検出安定化に応用するための実験を行なっている。分裂酵母ではPriAを大量に発現すると生育阻害が観察される。生育阻害の見えない程度に発現する株の作製を行なっている。
3: やや遅れている
進行中の複製が様々な原因で停止することは知られているものの、実際の生きた細胞内でフォーク停止を検出する技術はまだ確立されていない。大腸菌においても、PriAタンパク質が停止フォークを認識することは試験管内で以前から示されてきたが、細胞内で直接示した報告はない。今回、PriAタンパク質が生細胞内で実際に停止フォークに結合していることを証明したことは、PriAのフォーク安定化因子としての機能の確定に重要な寄与をするのみでなく、真核細胞を含めた実際の細胞内での停止フォーク安定化と不安定化回避に関わる反応を直接観察できる可能性を示すものであり、本分子機構の確立に向けた大きな前進と考えている。しかし、複製フォーク認識因子の酵母、動物細胞での発現により生育阻害が観察されるため、適切な量を発現することが必要である。この問題を解決し、早急に停止複製フォークの検出システムを確立する。
実際に特異的な領域で複製フォークが停止するような変異体、あるいは、PriAの機能を限定する変異体で、PriAのゲノム上での特異的結合を確認し、大腸菌細胞内停止フォーク検出技術を確立する。この技術を基盤として、分裂酵母及び動物細胞でPriAおよびRecGタンパク質をnative あるいは 蛍光タンパク質との融合タンパク質として発現し、薬剤等でフォーク不安定化を誘導したときに、これを停止複製フォークへの結合あるいは安定化が観察できるか検討する。又、PriAならびにRecGの欠失変異体解析により、最小機能ドメインを同定し、これを動物細胞内で発現させたときに、停止フォーク不安定化回避に機能するかどうかを確認する。これらの解析により、同定された最小ドメインが、真核細胞内での停止複製フォークを認識するかどうか検討する。
培養実験用の培地、血清、および染色体免疫沈降法に使用する一次抗体、二次抗体、加えて沈降してきたDNAを増幅する酵素等主に消耗品に使用する。また、フォーク停止を起こしやすい領域の網羅的検出は、マイクロアレイによるしか方法がないので、このchip購入費用を計上する。研究成果発表のための旅費等の費用も、妥当な額を計上した。
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