停止複製フォーク結合タンパク質による細胞内での複製フォークの安定化の試み

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 23657081
• 研究機関: 公益財団法人東京都医学総合研究所
• 研究代表者: 正井 久雄 公益財団法人東京都医学総合研究所, ゲノム医科学研究分野, 基盤技術研究センター長 (40229349)
• 研究分担者: 田中 卓 公益財団法人東京都医学総合研究所, ゲノム医科学研究分野, 主席研究員 (80425686)
• キーワード: PriAタンパク質 / 複製フォーク / 複製ストレス / 複製複合体 / チェックポイント応答 / 染色体脆弱部位 / DNA結合タンパク質 / 染色体不安定性症候群

研究概要

複製フォークの進行は種々の内的、外的な原因により頻繁に停止したり進行が阻害される。通常、停止複製フォークは細胞内の応答システムにより認識され、安定化され、染色体の不安定性の第一の原因は複製フォークの異常な巻き戻しによる崩壊である。研究代表者は大腸菌において、停止した複製フォークに結合し安定化する二個の因子PriAとRecGの解析を行なってきた。本提案は、これらの因子を用いて、真核細胞の停止複製フォークの安定化を促進する新規技術を開発し、これを最終的に染色体不安定性症候群にみられるフォークの不安定化を防ぐ新規戦略として応用しようとするものである。細胞内で停止したDNA複製フォークの安定化を促進する新規技術を開発するために、停止フォークを特異的に検出する方法をまず確立した。大腸菌PriAタンパク質に対する特異抗体を作製し、これを用いて、ChIP-on-chipによる解析を試みたところ、チミン枯渇処理によりフォークを停止させると、複製起点oriC付近に大きなピークのクラスターを見出した。この事は、PriAが細胞内で停止したフォーク構造に実際に結合し、チミン枯渇はoriC付近に停止フォークを蓄積させる可能性を示唆する。一方、oriCに依存せずに複製するrnhA株で同様の実験を行なったところterC終結領域にPriAは結合した。この事はterC領域にoriCに依存しない二次的複製起点があることを示唆する。次に、分裂酵母においてPriAタンパクを発現し、複製フォークをHUで停止し、PriAによりChIPを行った結果、複製起点近傍への集積が観察された。現在種々の変異体においてPriAを発現し、複製フォーク停止時に複製フォークの安定化が観察されるかどうかをRPAの結合による一本鎖 DNA領域の検出により検討している。

研究成果

• [雑誌論文] "Cell cycle synchronization and flow cytometry analysis of mammalian cell." (2014)
  • 著者名/発表者名: Yoshizawa-Sugata, N. and Masai, H
  • 雑誌名: Methods in Molecular Biology 巻: in press ページ: in press
  • 査読あり
• [雑誌論文] "ATM in prevention of genomic instability." (2014)
  • 著者名/発表者名: Hisao Masai
  • 雑誌名: Cell Cycle 巻: 13 ページ: 882-883
  • DOI: 10.4161/cc.28216
  • 査読あり
• [雑誌論文] "Temporal and spatial regulation of eukaryotic DNA replication: From regulated initiation to genome-scale timing program." (2014)
  • 著者名/発表者名: Claire Renard-Guillet, Yutaka Kanoh, Katsuhiko Shirahige, and Hisao Masai
  • 雑誌名: Seminars in Cell & Developmental Biology 巻: in press ページ: in press
  • DOI: 10.1016/j.semcdb
  • 査読あり
• [雑誌論文] A personal reflection on the Replicon Theory : from R1 plasmid to replication timing regulation in human cells (2013)
  • 著者名/発表者名: Masai, H
  • 雑誌名: J. Mol. Biol 巻: 425 ページ: 4663-4672
  • DOI: 10.1016/j.jmb.2013.03.039
  • 査読あり
• [雑誌論文] Replication timing regulation of eukaryotic replicons : Rif1 as a global regulator of replication timing (2013)
  • 著者名/発表者名: Yamazaki, S., Hayano, M. and Masai, H
  • 雑誌名: Trends in Genetics 巻: 29 ページ: 449-460
  • DOI: 10.1016/j.tig.2013.05.001
  • 査読あり
• [雑誌論文] "ATR-Chk1-APC/CCdh1-dependent stabilization of Cdc7-ASK(Dbf4) kinase complex is required for DNA damage bypass under replication stress." (2013)
  • 著者名/発表者名: Yamada, M., Watanabe, K., Mistrik, M., Mailand, N., Lee, M-H., Masai, H., Lukas, J. and Bartek, B
  • 雑誌名: Genes and Development 巻: 27 ページ: 2459-2472
  • DOI: 10.1101/gad.224568.113.
  • 査読あり
• [雑誌論文] "MCM helicase interacts with primase and stimulates its priming activity." (2013)
  • 著者名/発表者名: You, Z., De Falco, S., Pisani, F.M. and Masai, H
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 8 ページ: e72408
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0072408
  • 査読あり
• [雑誌論文] "The Human Tim/Tipin Complex Directly Interacts with DNA Polymerase {epsilon} and Stimulates its Synthetic Activity." (2013)
  • 著者名/発表者名: Aria, V., De Felice, M., Di Perna, R., Uno, S., Masai, H., Syvaoja, J.E., van Loon, B., Hubscher, U. and Pisani, F.M
  • 雑誌名: J. Biol. Chem 巻: 288 ページ: 12742-12752
  • DOI: 10.1074/jbc.M112.398073
  • 査読あり
• [雑誌論文] "Analysis of epigenetic stability and conversions in Saccharomyces cerevisiae reveals a novel role of CAF-I in position-effect variegation." (2013)
  • 著者名/発表者名: Jeffery, D.C., Wyse, B.A., Rehman, M.A., Brown, G.W., You, Z., Oshidari, R., Masai, H. and Yankulov, K.Y.
  • 雑誌名: Nucleic Acids Res 巻: 41 ページ: 8475-8488
  • DOI: 10.1093/nar/gkt623
  • 査読あり
• [雑誌論文] "Regulation of chromosome dynamics by Hsk1 kinase." (2013)
  • 著者名/発表者名: Matsumoto, S. and Masai, H
  • 雑誌名: Biochemical Society Transactions 巻: 41 ページ: 1712-1719
  • DOI: 0.1042/BST20130217
  • 査読あり
• [学会発表] "染色体DNA複製プログラムの制御機構と起源・進化" (2014)
  • 著者名/発表者名: 正井 久雄、田中 卓、加納 豊、山崎 聡志、松本 清治、吉沢 直子、松嶋 夢叶
  • 学会等名: The 2nd Symposium of Cell Cycle Control and Cell Fate (第２回 細胞周期制御と細胞運命 シンポジウム)
  • 発表場所: 浜松
  • 年月日: 20140213-20140214
  • 招待講演
• [学会発表] レプリコン仮説５０周年 (2013)
  • 著者名/発表者名: 正井 久雄
  • 学会等名: 第36回（2013年）日本分子生物学会年会，ワークショップ 「レプリコン仮説50周年：染色体複製装置の形成とその活性の時空間制御」
  • 発表場所: 福岡
  • 年月日: 20131203-20131206
  • 招待講演
• [学会発表] "Rif1: a potential global regulator of DNA replication, DNA repair, and recombination." (2013)
  • 著者名/発表者名: 正井 久雄、山崎 聡志、Lai Mongsing、Foiani Marco、吉沢 直子、加納 豊、松本 清治、森山賢治、覺正 直子、深津 理乃、松嶋 夢叶、河野 暢明、Renard-Guillet Claire
  • 学会等名: 第36回（2013年）日本分子生物学会年会，ワークショップ 「DNA二重鎖切断のend-resectionと修復機構の選択・制御」
  • 発表場所: 福岡
  • 年月日: 20131203-20131206
  • 招待講演
• [学会発表] Introductory Remarks (2013)
  • 著者名/発表者名: Hisao Masai
  • 学会等名: 86th Annual Meeting of the Japanese Biochemical Society
  • 発表場所: 福岡
  • 年月日: 20130914-20130916
  • 招待講演
• [学会発表] “Chromatin architecture that regulates replication timing of eukaryotic chromosomes.“ (2013)
  • 著者名/発表者名: Hisao Masai, Yutaka Kanoh, Satoshi Yamazaki, Motoshi Hayano, Naoko Yoshizawa, Kenji Moriyama, Yumeka Matsushima, Naoko Kakusho, and Rino Fukatsu
  • 学会等名: 第86回日本生化学会大会事務局 インターナショナルセッション「Assembly and architecture of protein complexes regulating inheritance and stable maintenance of genome」
  • 発表場所: 福岡
  • 年月日: 20130914-20130916
  • 招待講演
• [学会発表] "Control of origin firing timing in fission yeast cells" (2013)
  • 著者名/発表者名: Hisao Masai
  • 学会等名: EMBO Conference "Pombe 2013: 7th International Fission Yeast Meeting"
  • 発表場所: London UK
  • 年月日: 20130624-20130629
  • 招待講演