高感度光誘起膜電位センサ膜タンパク質の創製

2012 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 23657096
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 出村 誠 北海道大学, 先端生命科学研究科(研究院), 教授 (70188704)
• キーワード: オプトジェネティクス / 神経回路 / ハロロドプシン / 光遺伝学 / 膜タンパク質 / バイオコンピューター

研究概要

脳の神経回路研究は、ニューロン細胞情報処理機能を知ることだけでなく、新しいバイオコンピューターやロボットを作る工学的機能応用、精神神経疾患治療など、いずれも社会的ニーズの高い分野として注目されており、多様な分野への展開が期待されている。膜タンパク質ハロロドプシン（HR, 光駆動イオン輸送体）は、特定波長の光によって塩素イオンを一方向へポンプするので、神経興奮抑制の光膜電位制御素子として有望視されている。しかし光駆動塩素イオンポンプとして効率よく作動する可視光の波長範囲は限定的であるため、神経回路研究や治療応用への手法として応用範囲が限定的と考えられてきた。研究代表者らはHRの機能構造に関する先駆的な研究成果を基礎として、オプトジェネティクス法への最適な高感度HRのデザインを長期目標とし、本研究では（１）系統的な変異体作製で得られたHR試料の分光学的特性、（２）HRの４次構造(３量体安定化)と機能変調をそれぞれ解明する萌芽的研究計画し、以下の成果が得られた。古細菌由来の天然型HR（可視吸収極大吸収波長が578nm）の系統的な変異体20種の作製により、極大吸収波長シフトに効果がある特定アミノ酸残基を特定し、最大10nmのシフトが起こることが発見された。本研究では７回膜貫通ヘリックスのループ領域をターゲットとしたが、他の領域をさらに検討することで、波長シフト幅やシフト方向を最適化する研究が今後重要である。一方、HR分子同士には３量体形成能があり、この４次構造形成によってHR分子の構造安定化や光誘起反応への機能変調のオリジン研究展開が期待できた。そのためシアノバクテリアGloeobacterのロドプシンを対照区とし、古細菌HRの３量体形成能とは異なるリバーストリマーを証明するに至った。以上の成果は学術論文および海外国際会議で発表し、今後さらなる研究展開が期待できた。

研究成果

• [雑誌論文] Thermodynamic Parameters of Anion Binding to Halorhodopsin from Natronomonas pharaonis by Isothermal Titration Calorimetry (2013)
  • 著者名/発表者名: S. Hayashi, J. Tamogami, T. Kikukawa, H. Okamoto, K. Shimono, S. Miyauchi, M . Demura, T. Nara, N. Kamo
  • 雑誌名: Biophysical Chemistry 巻: 172 ページ: 61-67
  • DOI: DOI:10.1016/j.bpc.2013.01.001
  • 査読あり
• [雑誌論文] Salt Bridge in the Conserved His-Asp Cluster in Gloeobacter Rhodopsin Contributes to Trimer Formation (2013)
  • 著者名/発表者名: T. Tsukamoto,T. Kikukawa, T. Kurata, K.H. Jung, N.Kamo, M. D emura
  • 雑誌名: FEBS Lett 巻: 587 ページ: 322-327
  • DOI: DOI:10.1016/j.febslet.2012.12.022
  • 査読あり
• [雑誌論文] The Photo-induced Proton Release in Proteorhodopsin at Low pH: The Possibility of the pKa Decrease of Asp227 (2013)
  • 著者名/発表者名: J. Tamogami, T. Kikukawa, T. Nara, K. Shimono, M. Demura, N. Kamo, Naoki
  • 雑誌名: Biochemistry 巻: 51 ページ: 9290-9301
  • DOI: 10.1021/bi300940p
  • 査読あり
• [雑誌論文] Influence of halide binding on the hydrogen bonding network in the active site of Salinibacter sensory rhodopsin I (2012)
  • 著者名/発表者名: L. Reissig, T. Iwata, T. Kikukawa, M. Demura, N. Kamo, H. Kandori, Y. Sudo
  • 雑誌名: Biochemistry 巻: 51 ページ: 8802-8813
  • DOI: DOI:10.1021/bi3009592
  • 査読あり
• [雑誌論文] Dynamics of Dangling Bonds of Water Molecules in pharaonis Halorhodopsin during Chloride Ion Transportation (2012)
  • 著者名/発表者名: Y. Furutani, K. Fujiwara, T. Kimura, T. Kikukawa, M . Demura, H. Kandori
  • 雑誌名: J.Phys.Chem.Lett 巻: 3 ページ: 2964-2969
  • DOI: DOI:10.1021/jz301287n
  • 査読あり
• [雑誌論文] Protein-Bound Water as the Determinant of Asymmetric Functional Conversion between Light-Driven Proton and Chloride Pumps (2012)
  • 著者名/発表者名: K. Muroda, K. Nakashima, M. Shibata, M. Demura, H. Kandori
  • 雑誌名: Biochemistry 巻: 51 ページ: 4677-4684
  • DOI: 10.1021/bi300485r
  • 査読あり
• [雑誌論文] Homo-trimer Formation and Dissociation of pharaonis Halorhodopsin in Detergent System (2012)
  • 著者名/発表者名: T. Tsukamoto, T. Sasaki, K. J. Fujimoto, T. Kikukawa, M. Kamiya, T. Aizawa, K. Kawano, N. Kamo, M. Demura
  • 雑誌名: Biophysical J. 巻: 102 ページ: 2906-2915
  • DOI: 10.1016/j.bpj.2012.05.008
  • 査読あり
• [雑誌論文] Photo-induced Bleaching of Sensory Rhodopsin II (Phoborhodopsin) from Halobacterium salinarum by Hydroxylamine: Identification of the Responsible Intermediates (2012)
  • 著者名/発表者名: J. Tamogami, T. Kikukawa, Y. Ikeda, M. Demura, T. Nara, N. Kamo
  • 雑誌名: Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 巻: 106 ページ: 87-94
  • DOI: 10.1016/j.jphotobiol.2011.10.009
  • 査読あり
• [学会発表] 固体 NMR におけるタンパク質連鎖帰属への GFT NMR 法の応用 (2013)
  • 著者名/発表者名: 田巻 初 、江川 文子、神谷 昌克、菊川 峰志、相沢 智康、河野 敬一、藤原 敏道 、出村 誠
  • 学会等名: NMR討論会
  • 発表場所: ウィンクあいち（名古屋市）
  • 年月日: 20130305-20130305
• [学会発表] 光駆動型Cl-ポンプ ハロロドプシンのpH依存的な光反応サイクルの変化：Cl-輸送に関与する荷電性残基の探索 (2013)
  • 著者名/発表者名: 大塚 瞭、菊川 峰志、神谷 昌克、相沢 智康、河野 敬一、加茂 直樹、出村 誠
  • 学会等名: 日本生物物理学会北海道支部例会
  • 発表場所: 北海道大学理学部（札幌市）
  • 年月日: 20130305-20130305
• [学会発表] 時間分解FTIR計測によるpHRのイオン輸送における水分子の挙動変化解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 藤原邦代、木村哲就、菊川峰志、出村誠、神取秀樹、古谷祐詞
  • 学会等名: 2012年度日本生物物理学会中部支部講演会
  • 発表場所: 名古屋大学野依記念学術交流館（名古屋市）
  • 年月日: 20130219-20130219
• [学会発表] Light-induced proton transfer reactions of cyanobacterial photoreceptor protein Anabaena Sensory rhodopsin (2012)
  • 著者名/発表者名: Takatoshi Hasem, Takashi Kikukawa, Masakatsu Kamiya, Tomoyasu Aizawa, Keiichi Kawano, K.-H. Jung, Naoki Kamo and Makoto Demura
  • 学会等名: 13th Chitose International Forum
  • 発表場所: 千歳科学技術大学（千歳市）
  • 年月日: 20121011-20121012
• [学会発表] The effect of halide binding on the hydrogen bonding network in the active site of Salinibacter sensory rhodopsin I. (2012)
  • 著者名/発表者名: Reissig, L., Iwata, T., Kikukawa, T., Demura, M., Kamo, N., Kandori, H., and Sudo, Y.
  • 学会等名: 15th Int Conf. Retinal Proteins
  • 発表場所: Ascona, Switzerland
  • 年月日: 20120930-20121005
• [学会発表] Homo-trimeric structure of Gloeobacter rhodopsin is regulated by the protonation state of Asp121, a counterion of the protonated Schiff base (2012)
  • 著者名/発表者名: Takashi Tsukamoto, Takashi Kikukawa, Masakatsu Kamiya, Tomoyasu Aizawa, Keiichi Kawano, Kwang-Hwan Jung, Naoki Kamo and Makoto Demura
  • 学会等名: 15th Int Conf. Retinal Proteins
  • 発表場所: Ascona, Switzerland
  • 年月日: 20120930-20121005
• [学会発表] When does halorhodopsin capture and release Cl- during photocycle? Examination by spectrum changes of an intrinsic voltage-sensitive dye, Bacterioruberin (2012)
  • 著者名/発表者名: Takatoshi Hasem, Takashi Kikukawa, Masakatsu Kamiya, Tomoyasu Aizawa, Keiichi Kawano, K.-H. Jung, Naoki Kamo and Makoto Demura
  • 学会等名: 15th Int Conf. Retinal Proteins
  • 発表場所: Ascona, Switzerland
  • 年月日: 20120930-20121005
• [学会発表] Structure and Molecular Function of Halorhodopsin (2012)
  • 著者名/発表者名: Demura Makoto
  • 学会等名: 日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 名古屋大学東山キャンパス（名古屋市）
  • 年月日: 20120922-20120924
  • 招待講演
• [学会発表] Photo-induced proton transfer of Anabaena sensory rhodopsin (2012)
  • 著者名/発表者名: 長谷見崇俊、菊川峰志、神谷昌克、相沢智1、河野敬一、Kwang-Hwan Jung、加茂直樹、出村誠
  • 学会等名: 日本生物物理学会
  • 発表場所: 名古屋大学東山キャンパス（名古屋市）
  • 年月日: 20120922-20120924
• [学会発表] Homo-trimeric assembly of a cyanobacterial ion-pump Gloeobacter rhodopsin グロエオバクターロドプシンの三量体形成に関する研究 (2012)
  • 著者名/発表者名: 塚本 卓、菊川 峰志、神谷 昌克、 相沢 智康、河野 敬一、Jung Kwang-Hwan、 加茂 直樹、出村 誠
  • 学会等名: 日本生物物理学会
  • 発表場所: 名古屋大学東山キャンパス（名古屋市）
  • 年月日: 20120922-20120924
• [学会発表] Water hydrogen-bonding dynamics in the function of pharaonis halorhodopsin studied by time-resolved FTIR spectroscopy (2012)
  • 著者名/発表者名: 藤原邦代、木村哲就、菊川峰志、出村誠、神取秀樹、古谷祐詞
  • 学会等名: 日本生物物理学会
  • 発表場所: 名古屋大学東山キャンパス（名古屋市）
  • 年月日: 20120921-20120924
• [学会発表] The role of chloride in the photo-induced proton transfer in sensory rhodopsin II from Natronomonas pharaonis Natronomonas pharaonis由来のセンサリーロドプシンIIの光誘起プロトン移動における塩化物イオンの役割 (2012)
  • 著者名/発表者名: 田母神 淳、岩野 亮宗 、松山 淳 、菊川 峰志 、出村 誠、下野 和実、奈良 敏文、加茂 直樹
  • 学会等名: 日本生物物理学会
  • 発表場所: 名古屋大学東山キャンパス（名古屋市）
  • 年月日: 20120920-20120924
• [学会発表] ナノディスクを用いた膜タンパク質ハロロドプシンの機能解析 (2012)
  • 著者名/発表者名: 山本 愛弓、塚本 卓、小橋川 敬博、 内田 毅、出村 誠、稲垣 冬彦、石森 浩一郎
  • 学会等名: 日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: 名古屋国際会議場（名古屋市）
  • 年月日: 20120620-20120629
• [学会発表] 三次元固体 NMR 法による膜タンパク質ハロロドプシンの研究 (2012)
  • 著者名/発表者名: 田巻 初、江川 文子、神谷 昌克、 菊川 峰志、相沢 智康、河野 敬一、 藤原 敏道、出村 誠
  • 学会等名: 日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: 名古屋国際会議場（名古屋市）
  • 年月日: 20120620-20120622
• [学会発表] ハロロドプシンの光反応サイクル中に起こるカロテノイドの吸光度変化 (2012)
  • 著者名/発表者名: 菊川峰志、小久保麻美、塚本卓、 橋本革、 井原邦夫、 加茂直樹、 出村誠
  • 学会等名: 日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: 名古屋国際会議場（名古屋市）
  • 年月日: 20120620-20120622
• [学会発表] 膜タンパク質ハロロドプシンの人工脂質二重膜ナノディスクへの再構成 (2012)
  • 著者名/発表者名: 山本愛弓・塚本卓・小橋川敬博・内田毅・出村 誠・稲垣冬彦・石森浩一郎
  • 学会等名: 第 9 回ホスト・ゲスト化学シンポジウム
  • 発表場所: 北海道大学札幌キャンパス（札幌市）
  • 年月日: 20120526-20120527
• [図書] 光のエネルギー利用・ハロロドプシン『光と生命の事典』日本光生物学協会 (2014)
  • 著者名/発表者名: 出村誠（共著）
  • 総ページ数: 450
  • 出版者: 朝倉書店
• [図書] ハロロドプシンの構造と分子機能解析『オプトジェネティクス（光遺伝学）-光工学と遺伝子による行動制御技術の最前線-』 (2013)
  • 著者名/発表者名: 出村誠（共著）
  • 総ページ数: 24-33
  • 出版者: エヌ・ティー・エス
• [備考] タンパク質にかくされた" プロテイン・コード"を解く！
  • URL: http://www.lfsci.hokudai.ac.jp/labs/infana/research2.html
• [備考] ダイナミクスインフォマ ティクス「光で動くタンパク質・イオンポンプ」
  • URL: http://www.lfsci.hokudai.ac.jp/labs/infana/topics/2006/index.html