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新規のタンパク質－DNA間の相互作用検出系を構築することが本研究の目的である。ここでは、既存のタンパク質－タンパク質相互作用を検出するPLA法を改変した系を検討した。すなわち、トマトのMADSボックス転写因子RINと既知の標的配列との相互作用を検出するために、転写因子タンパク質に対する抗体にプローブ用DNAを結合したものと、標的配列にもプローブ用DNAを結合し、両者のプローブ用DNAが近接して存在した場合、リンカーDNAを介したライゲーション反応によりプローブDNAが結合し、それぞれのプローブDNAに相補なプライマーでリアルタイムPCRを行うことにより、結合を検出する。昨年度までに相互作用が検出できなかった原因として、それぞれのプローブが一分子の複合体に対して一カ所ずつしか認識部位がないためだと予想した。そこで、RINタンパク質にGFPタンパク質を融合したキメラタンパク質を用意し、GFPタンパク質全体に対するポリクローナル抗体をプローブとして使用することにした。キメラタンパク質がDNA結合性を有することはゲルシフトアッセイにより確認した。キメラタンパク質を無細胞系で合成し、標的DNAと結合反応させ、本系での検出を試みた。ゲルシフトアッセイにおいて標的DNAとして、強く結合が認められるもの、弱く結合するもの、結合が認められないものを比較した。その結果、リアルタイムPCRにより、既知の結合強度の順にプローブDNA間の結合反応が生じた割合が高く検出されたが、その差は期待ほどには大きくなかった。プローブ濃度、タンパク質量、反応バッファー等の種々の実験パラメーターの調節を行ったが、本研究期間内に統計的な有意差を示す差を検出するには至らず、ゲルシフトアッセイよりも検出感度的に劣っていると判断せざるを得ない結果となった。
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