| 研究課題/領域番号 |
23659026
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
森下 義幸 自治医科大学, 医学部, 助教 (30570494)
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| 研究期間 (年度) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| キーワード | ドラッグ・デリバリ- / 遺伝子治療 / 腎線維化 |
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| 研究概要 |
In vitroでの検討として、TGF-β1刺激下でHK-2細胞の上皮間葉移行(EMT）を最も強力に抑制するsiRNAとしてsamd4-siRNAを同定した。続いてペプチド（Lys-Lys-Arg-Arg）をsamd4-siRNAに結合させた複合体（peptide-samd4-siRNA）および25-hydroxy vitamin D(25OHD3)をsamd4-siRNAに結合させた複合体(25OHD3-samd4-siRNA)をそれぞれシグマアルドリッチ社およびジーンデザイン社に委託して作成した。次にTGF-β1で刺激したHK-2細胞でpeptide-samd4-siRNAおよび25OHD3-samd4-siRNAのsmad4遺伝子の抑制効果とEMT抑制効果を検討した。その結果、TGF-β1で刺激したHK-2細胞ではpeptide-samd4-siRNAおよび25OHD3-samd4-siRNAの両者で有効なsmad4遺伝子の抑制とEMT抑制効果が認められなかった。In vivoの検討として、葉酸腹腔内投与により腎線維化を誘導したモデルマウスにpeptide-samd4-siRNA, 25OHD3-samd4-siRNAおよび未修飾smad4-siRNAを尾静脈より週3回3週間投与して腎線維化抑制効果を検討した。その結果、未修飾smad4-siRNA投与群で最も高いsmad4 mRNAの抑制が認められ、腎線維化が抑制された。さらにこのsmad4-siRNA投与による腎線維化の抑制機序として尿細管上皮細胞のEMT抑制に加え、腎微小血管のpericyteの尿細管間質への移動・増殖抑制が示唆される結果が得られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
in vitroの実験結果から尿細管上皮細胞の上皮間葉転換抑制（EMT)に最適のsiRNA（smad4-siRNA)を同定できた。in vivoの実験結果からペプチド（Lys-Lys-Arg-Arg）, 25OHD3で修飾したsmad4-siRNA（peptide-smad4-siRNAおよび25OHD3-smad4-siRNA)および未修飾 smad4-siRNAを葉酸腹腔内投与により誘導した腎線維化モデルマウスの尾静脈より投与したところ、peptide-smad4-siRNAおよび25OHD3-smad4-siRNAでは有効な腎線維化抑制効果が認められなかったが、未修飾smad4-siRNA投与で有効な腎線維化抑制効果を認めた。さらにこの未修飾smad4-siRNA投与による腎線維化抑制効果の機序として尿細管上皮細胞のEMT抑制効果に加えpericyteの微小血管から尿細管間質への移動・増殖抑制効果も関与している可能性がわかった。これらの結果は当初目標としていた、簡便な静脈投与による腎線維化抑制のための遺伝子治療の確立へつながる結果であると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
葉酸腹腔内投与により誘導した腎線維化モデルマウスの尾静脈よりsmad4-siRNA（1回 5nmol)を週に3回3週間投与する。コントロール群として同線維化モデルマウスに同様にcontrol-siRNA(non-targeted siRNA)（1回 5nmol)を投与する。投与後、腎線維化マウスの腎臓での線維化の程度を組織学的にHE染色、Azan染色等を用いてsmad4-siRNA投与群、control-siRNA投与群で比較検討する。また腎組織のpericyte marker(PDGFreceptor beta, NG2 chondroitin sulfate)、尿細管上皮マーカー（e-cadherin, occudin)、線維芽細胞マーカー(alfa-SMA, fibronectin1)の発現変化をsmad4-siRNA投与群、control-siRNA投与群でqRT-PCR法、免疫染色法で比較検討する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
葉酸腹腔内投与による腎線維化モデルマウスの作成。smad4-siRNA, non targeteed-siRNAの購入。pericyte marker(PDGF receptor beta, NG2 chondroitin sulfate)、尿細管上皮マーカー（e-cadherin, occudin)、線維芽細胞マーカー(alfa-SMA, fibronectin1)の抗体購入。免疫染色試薬購入。qRT-PCR試薬購入。
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