１発の活動電位発生により細胞死に至る細胞の作製と新規創薬スクリーニング系の開発

2011 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 23659046
• 研究機関: 名古屋市立大学
• 研究代表者: 今泉 祐治 名古屋市立大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (60117794)
• 研究分担者: 大矢 進 名古屋市立大学, 薬学研究科(研究院), 准教授 (70275147) ; 山村 寿男 名古屋市立大学, 薬学研究科(研究院), 講師 (80398362)
• 研究期間 (年度): 2011-04-28 – 2013-03-31
• キーワード: イオンチャネル / 活動電位 / ナトリウムチャネル / 細胞死 / イオンチャネル標的創薬 / 高効率探索系

研究概要

活動電位を発生する興奮性細胞において、電位依存性Na+チャネルは活動電位という高速シグナルの担い手分子であり、活性化に続く極めて速やかな不活性化がその分子機能を可能にしている。一方、電位依存性Na+チャネルが過剰に活性化されると様々な疾患をもたらす。遺伝子異常を含む何らかの原因による不活性化の遅延は、特定のてんかんや不整脈など極めて重篤な疾患をもたらす。トリカブト毒成分のアコニチンなど数種の低分子化合物は、Na+チャネル不活性化を遅延させ、活動電位幅延長を引き起こすことにより毒性を発揮する。そのため電位依存性Na+チャネルの不活性化機構は詳細に研究され、不活性化を担う複数部位のアミノ酸群が同定され、それらのアミノ酸を遺伝子点変異により置換すると不活性化が遅延され、そのような変異Na+チャネル発現細胞は死に易いことが明らかとなっている。　　本研究の目的は、不活性化遅延性の変異型Na+チャネルを定常発現した細胞を作成し、これを用いて過剰なNa+流入による細胞内Na+貯留の定量的解析やそれによる細胞障害発生機構の解明を行うことである。さらに1発の活動電位発生で細胞死に至るその細胞系をイオンチャネル標的創薬の高効率スクリーニングシステムへ応用することである。不活性化の遅い遺伝子変異を導入したNa+チャネル（変異Nav1.5）と深い静止膜電位を保持するための内向き整流性K+チャネル（Kir2.1）を同時にHEK293細胞に定常発現させた試験細胞を作成し、電気刺激により持続性活動電位が発生し、１発の活動電位により短時間（5分以内）で細胞死に至ることを見出した。さらに薬物誘発性不整脈の安全性試験に不可欠なhERG K+チャネルをさらに共発現することにより、新たな薬物の安全性試験用スクリーニングシステムとして実用可能であることを示した（J Biomolec Scr, 2012）。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

変異型Na+チャネルとKir2.1を定常発現したHEK293細胞（試験細胞）を作成し、電気刺激により１発の活動電位が発生することにより、活動電位が１分以上も継続し、５分以内に確実に細胞死が生じることを明らかにしたまたhERG K+チャネルを基本細胞に定常発現させた細胞の作成を23年度に達成した。この細胞を利用してhERG K+ チャネル阻害による薬物の催不整脈作用のスクリーニングが可能であることを示した（J Biomolec Scr, 2012）。本来、これは平成24年度に実施する予定であったが、前倒しした。さらに5-HT3受容体などの受容体刺激により脱分極を引き起こすイオンチャネル型受容体遺伝子を、試験細胞に加えて発現させることにより、受容体作用薬や拮抗薬の探索系の構築の可能性を示した（投稿準備中）。

今後の研究の推進方策

変異型Na+チャネルとKir2.1を定常発現させた試験細胞に5-HT3受容体を加えて発現させた細胞系を利用することにより、5-HT3受容体作用薬や拮抗薬の探索系を確立する。同様にニコチン受容体を発現させた系を開発し、この「１発の活動電位発生により細胞死が生じる系」を用いる化合物探索法の一般性と有用性を示す。急速に細胞内Na+濃度が上昇した場合に生じる細胞死の機序について、細胞内Na+濃度とCa2+濃度の持続性活動電位中の変化を観測することになどにより解明する。

次年度の研究費の使用計画

各種イオンチャネル遺伝子を定常発現させたHEK293細胞の作成に必要なベクター、遺伝子導入用試薬、抗生物質、細胞培養用試薬などを購入する。細胞内Na+やCa2+濃度を測定するための各イオン感受性蛍光色素や各種薬物などの化合物を購入する。

研究成果

• [雑誌論文] Development of Recombinant Cell Line Co-expressing Mutated Nav1.5, Kir2.1, and hERG for the Safety Assay of Drug Candidates (2012)
  • 著者名/発表者名: Fujii et al.
  • 雑誌名: J Biomol Screen 巻: in press ページ: in press
  • DOI: 10.1177/1087057112442102
  • 査読あり
• [雑誌論文] Molecular Assembly and Dynamics of Fluorescent Protein-Tagged Single KCa1.1 Channel in Expression System and Vascular Smooth Muscle Cells (2012)
  • 著者名/発表者名: Yamamura et al.
  • 雑誌名: Am J Physiol Cell Physiol 巻: 302 ページ: C1257-68
  • DOI: 10.1152/ajpcell.00191.2011
  • 査読あり
• [雑誌論文] Serotonin augments gut pacemaker activity via 5-HT3 receptors (2011)
  • 著者名/発表者名: Liu HN, Ohya S, Nishizawa Y, Sawamura K, Iino S, Syed MM, Goto K, Imaizumi Y, Nakayama S
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 6(9) ページ: e24928
  • DOI: DOI:10.1371/journal.pone.0024928
  • 査読あり
• [雑誌論文] TRIC-A channels in vascular smooth muscle contribute to blood pressure maintenance (2011)
  • 著者名/発表者名: Yamazaki D, Tabara Y, Kita S, Hanada H, Komazaki S, Naitou D, Mishima A, Nishi M, Yamamura H, Yamamoto S, Kakizawa S, Miyachi H, Yamamoto S, Miyata T, Kawano Y, Kamide K, Ogihara T, Hata A, Umemura S, Soma M, Takahashi N, Imaizumi Y, Miki T, Iwamoto T, Ta
  • 雑誌名: Cell Metab 巻: 14(2) ページ: 231-41
  • DOI: DOI:10.1016/j.cmet
  • 査読あり
• [雑誌論文] Involvement of dominant-negative spliced variants of the intermediate conductance Ca2+-activated K+ channel, KCa3.1, in immune function of lymphoid cells (2011)
  • 著者名/発表者名: Ohya et al.
  • 雑誌名: J Biol Chem 巻: 286(19) ページ: 16940-52
  • DOI: 10.1074/jbc.M110.184192
  • 査読あり
• [雑誌論文] Up-regulation of Kir2.1 by ER stress facilitates cell death of brain capillary endothelial cells (2011)
  • 著者名/発表者名: Kito et al.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun 巻: 411(2) ページ: 293-8
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2011.06.128
  • 査読あり
• [雑誌論文] Intermediate-conductance Ca2+-activated K+ channel, KCa3.1, as a novel therapeutic target for benign prostatic hyperplasia (2011)
  • 著者名/発表者名: Ohya et al.
  • 雑誌名: J Pharmacol Exp Ther 巻: 338(2) ページ: 528-36
  • DOI: 10.1124/jpet.111.182782
  • 査読あり
• [雑誌論文] イオンチャネル標的創薬におけるHTSの現状と展望 (2011)
  • 著者名/発表者名: 藤井将人 他
  • 雑誌名: 日薬理誌 巻: 138(6) ページ: 229-33
  • DOI: 10.1254/fpj.138.229
• [学会発表] 平滑筋臓器におけるCa2+クロックとペースメーキング機能 (2012)
  • 著者名/発表者名: 今泉祐治
  • 学会等名: 第89回日本生理学会大会(招待講演)
  • 発表場所: 松本
  • 年月日: 2012年3月29日
• [学会発表] 腎動脈結紮高血圧モデルマウスにおける血管径制御機構に対する内向き整流性K+チャネル（Kir2.1）の寄与 (2012)
  • 著者名/発表者名: 丸山史登
  • 学会等名: 第85回日本薬理学会年会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2012年3月15日
• [学会発表] 接触過敏症モデルマウスの耳介リンパ節Tリンパ球におけるCa2+活性化K+チャネルKCa3.1の役割 (2012)
  • 著者名/発表者名: 大矢 進
  • 学会等名: 第85回日本薬理学会年会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2012年3月15日
• [学会発表] 平滑筋細胞におけるTMEM16 familyの発現とCa2+活性化Cl-チャネル活性 (2012)
  • 著者名/発表者名: 大城隼也
  • 学会等名: 第85回日本薬理学会年会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2012年3月15日
• [学会発表] 一発の活動電位発生により細胞死を起こす遺伝子改変導入細胞を用いた電位依存性K+チャネルスクリーニング法の開発 (2012)
  • 著者名/発表者名: 藤井将人
  • 学会等名: 第85回日本薬理学会年会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2012年3月15日
• [学会発表] 脳血管内皮細胞の細胞増殖におけるCRACチャネルの寄与 (2012)
  • 著者名/発表者名: 鬼頭宏彰
  • 学会等名: 第85回日本薬理学会年会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2012年3月14日
• [学会発表] 気管上皮繊維細胞における膜電位と細胞内カルシウム濃度の関係 (2012)
  • 著者名/発表者名: 大羽輝弥
  • 学会等名: 第85回日本薬理学会年会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2012-03-16
• [学会発表] 前立腺肥大モデルラットの移植排尿生殖洞における大コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネル発現 (2012)
  • 著者名/発表者名: 丹羽里実
  • 学会等名: 第85回日本薬理学会年会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2012-03-15
• [学会発表] ラット松果体における過分極活性化環状ヌクレオチド依存性チャネル発現解析 (2012)
  • 著者名/発表者名: 清田恵子
  • 学会等名: 第85回日本薬理学会年会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2012-03-14
• [学会発表] BKチャネル-Cav1.2複合体形成及び血管平滑筋細胞機能に対するカベオリン1/カベオラの役割 (2011)
  • 著者名/発表者名: 鈴木良明
  • 学会等名: 第21回日本循環薬理学会
  • 発表場所: 岡山
  • 年月日: 2011年12月2日