| 研究課題/領域番号 |
23659111
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
藤原 祐一郎 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (20532980)
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| キーワード | イオンチャネル / レドックス |
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| 研究概要 |
（全体構想）：本研究は、免疫系やストレス応答、脳神経機能において重要な働きを持つ酸化還元状態を可視化し、酸化還元シグナルが種々の臓器・細胞において果たす役割を解明します。
（具体的目的）：細胞内の酸化還元の状態を測定するためのFRETベースの蛍光分子プローブを高解像度結晶構造が解けたイオンチャネルの細胞内コイルドコイルドメインを基にデザインします。開発した酸化還元蛍光分子プローブを活動する生きた細胞、具体的には貪
食細胞やミクログリアに発現させ、種々の活動ステージにおける酸化還元の状態や、病的に酸化ストレスにさらされた時の細胞内レドックス応答をリアルタイムに非侵襲的に測定します。
活動する細胞の酸化還元状態をリアルタイムに測定することを目的に、細胞への遺伝子導入する形で使用する酸化還元分子プローブを作成する。一対のCys残基を有するH+チャネル細胞内ドメイン2量体コイルドコイルを利用して、酸化還元に応答するプローブを作成することを試みた。本年度はそのため、細胞内領域の高解像度の結晶構造解析を行い、酸化還元2状態の結晶構造を高解像度で決定することに成功した。H+チャネルの細胞内領域は見事に酸化還元に応答して構造を変化させることを明らかにした。さらに、種々の酸化還元定数を有するバライティーに富んだプローブを作成することを試みて、種々の変異体コイルドコイルコンストラクトを作成し、大腸菌発現システムを用いてコイルドコイル蛋白を発現させ、FPLCクロマトグラフィーで高純度に精製し、熱安定性を指標にして酸化還元定数を測定した。これらのコイルドコイルの一方にドナーとなるCFP、もう片方にアクセプターとなるYFPをつなげたコンストラクトを作成し、キュベット内での酸化還元に対する応答を、FRETシグナルを測定することにより解析することを試みた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
当初の目的である細胞内の酸化還元の状態を測定するために、イオンチャネルの細胞内コイルドコイルドメインを利用することにした。その領域の結晶構造を解析することに成功し、新たにチャネルそのものが酸化還元に搬送して構造が変化するドメインを細胞内に有することを見いだした（現在投稿論文リバイス中）。それ以外に、イオンチャネルの温度依存的に会合・解離する細胞内コイルドコイルドメインがチャネル活性の温度域値を決定している事を見いだし、Nature communications誌に発表した。この成果は、新聞TV等で広く取り上げられ、研究成果が国民に広く普及した。また、2量体に最適化された会合構造を有することでチャネル機能が最適化されていることを明らかにし、Journal of Physiology誌へ発表した。をこのように、計画以上の進展があった。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後、生きた細胞へコイルドコイル蛋白を発現させ、酸化還元に応答した蛋白の変化をモニターする。
「貪食細胞における酸化還元状態のモニター」マウスから採取した好中球・マクロファージに蛍光分子プローブをトランスフェクションし発現させFRETシグナルの測定を行う。測定のゴールは貪食細胞の遊走・浸潤・貪食・ケモカインといった種々のステージでの酸化還元状況をリアルタイムにモニターすることである。
「ミクログリアにおける酸化還元状態のモニター」
酸化ストレスに応答した脳内ミクログリアの神経保護活動のメカニズムの一端を解明する目的で行う。作成した蛍光分子プローブをミクログリアに遺伝子導入し発現させ、顕微鏡下で休止期から活動期に変わるミクログリアの酸化還元状態をモニターする。H2O2による酸化ストレスを与えた時、あるいは脳虚血による酸欠状態の細胞内酸化還元状態の変化を観察する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
当初計画では平成24年7月までにイオンチャネルの改変をし、平成25年3月までにチャネルの細胞への応用をおこない細胞の酸化還元状態を解析し、研究成果の取りまとめを行う予定であった。しかし、平成24年8月に、チャネルそのものが酸化還元に応答するという新知見を見いだした。細胞に応用し正確な酸化還元状態の解析のためチャネルそのものの解析を優先した（投稿中）。そのため、細胞に応用して解析する実験のやむを得ない遅延が生じ、期間延長が認められた。今後、細胞へ応用した解析を追加実験として進めていくための資金、及び、結果の取りまとめ、論文投稿出版費用が必要となる。使途内容は、「物品費」として400,000円、「人件費・謝金」として100,000円、その他雑費として100,000円とする。
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