活動する細胞の酸化還元状態を可視化する

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 23659111
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 藤原 祐一郎 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (20532980)
• キーワード: イオンチャネル / レドックス

研究概要

（全体構想）：本研究は、免疫系やストレス応答、脳神経機能において重要な働きを持つ酸化還元状態を可視化し、酸化還元シグナルが種々の臓器・細胞において果たす役割を解明します。
（具体的目的）：細胞内の酸化還元の状態を測定するためのFRETベースの蛍光分子プローブを高解像度結晶構造が解けたイオンチャネルの細胞内コイルドコイルドメインを基にデザインします。開発した酸化還元蛍光分子プローブを活動する生きた細胞、具体的には貪食細胞やミクログリアに発現させ、種々の活動ステージにおける酸化還元の状態や、病的に酸化ストレスにさらされた時の細胞内レドックス応答をリアルタイムに非侵襲的に測定します。活動する細胞の酸化還元状態をリアルタイムに測定することを目的に、細胞への遺伝子導入する形で使用する酸化還元分子プローブを作成する。一対のCys残基を有するH+チャネル細胞内ドメイン2量体コイルドコイルを利用して、酸化還元に応答するプローブを作成することを試みた。細胞内領域の高解像度の結晶構造解析を行い、酸化還元2状態の結晶構造を高解像度で決定することに成功した。H+チャネルの細胞内領域は見事に酸化還元に応答して構造を変化させることを明らかにした。さらに、種々の酸化還元定数を有するバライティーに富んだプローブを作成することを試みて、種々の変異体コイルドコイルコンストラクトを作成し、大腸菌発現システムを用いてコイルドコイル蛋白を発現させ、FPLCクロマトグラフィーで高純度に精製し、熱安定性を指標にして酸化還元定数を測定した。本年度は結果のまとめと報告を行い、学術論文を発表した

研究成果

• [雑誌論文] Long α-helices projecting from the membrane as the dimer interface in the voltage-gated H+ channel (2014)
  • 著者名/発表者名: Fujiwara Y., Kurokawa T., Okamura Y.
  • 雑誌名: Journal of General Physiology 巻: 143 ページ: 377-386
  • DOI: 10.1085/jgp.201311082
  • 査読あり
• [雑誌論文] X-ray Crystal Structure of Voltage-gated Proton Channel (2014)
  • 著者名/発表者名: Takeshita K., Sakata S., Yamashita E., Fujiwara Y., Kawanabe A., Kurokawa T., Okochi Y., Matsuda M., Narita H., Okamura Y., Nakagawa A.
  • 雑誌名: Nature Structural & Molecular Biology 巻: 21 ページ: 352-357
  • DOI: 10.1038/nsmb.2783
  • 査読あり
• [雑誌論文] Gating of the Designed Trimeric/Tetrameric Voltage-Gated H+ Channel (2013)
  • 著者名/発表者名: Fujiwara Y., Kurokawa T., Takeshita K., Nakagawa A., Larsson HP., Okamura Y.
  • 雑誌名: Journal of Physiology 巻: 591 ページ: 627-640
  • DOI: 10.1113/jphysiol.2012.243006
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural Characteristics of the Redox Sensing Coiled-coil in the Voltage-gated H+ Channel (2013)
  • 著者名/発表者名: Fujiwara Y., Takeshita K., Nakagawa A., Okamura Y.
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 巻: 288 ページ: 17968-17975
  • DOI: 10.1074/jbc.M113.459024
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structure and function of dimeric assembly in voltage-gated H+ channel (2013)
  • 著者名/発表者名: Fujiwara Y., Nakagawa A., Okamura Y.
  • 雑誌名: Spring-8 Research Frontiers 2012 巻: 2012 ページ: 14-15
  • 査読あり
• [学会発表] 電位依存性プロトンチャネル VSOP/Hv1 の動作原理 (2014)
  • 著者名/発表者名: 岡村康司、藤原祐一郎、川鍋陽、坂田宗平、黒川竜紀
  • 学会等名: 第91回日本生理学会大会
  • 発表場所: 鹿児島
  • 年月日: 20140318-20140318
  • 招待講演
• [学会発表] Long alpha-helices projecting from the membrane as the dimer interface in the voltage-gated H+ channel (2014)
  • 著者名/発表者名: 藤原祐一郎、黒川竜紀、岡村康司
  • 学会等名: 第58回米国生物物理学会大会
  • 発表場所: San Francisco（米国）
  • 年月日: 20140219-20140219
• [学会発表] X-RAY CRYSTAL STRUCTURE OF VOLTAGE GATED PROTON CHANNEL (2014)
  • 著者名/発表者名: 竹下浩平、坂田宗平、山下栄樹、藤原祐一郎、川鍋陽、黒川竜紀、大河内善史、松田真、 成田宏隆、岡村康司、中川敦史
  • 学会等名: 第58回米国生物物理学会大会
  • 発表場所: San Francisco（米国）
  • 年月日: 20140219-20140219
• [学会発表] Voltage Sensing Mechanism in the Voltage-Gated H+ Channel (2014)
  • 著者名/発表者名: 藤原祐一郎, 岡村康司
  • 学会等名: 第91回日本生理学会大会
  • 発表場所: 鹿児島
  • 年月日: 2014-03-16
• [学会発表] Structural Characteristics of the Redox Sensing Coiled-coil in the Voltage-gated H+ Channel (2013)
  • 著者名/発表者名: 藤原祐一郎, 竹下浩平, 中川敦史, 岡村康司
  • 学会等名: 第2回 HD Physiology 国際シンポジウム
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 20130628-29
• [学会発表] Continuous α-helices of S4 and coiled-coil form the dimer interface in the voltage-gated H+ channel (2013)
  • 著者名/発表者名: 藤原祐一郎、黒川竜紀、岡村康司
  • 学会等名: 第2回 HD Physiology 国際シンポジウム
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 20130628-20130629
• [学会発表] Molecular diversities of voltage sensing: from ion permeation to enzyme (2013)
  • 著者名/発表者名: 岡村康司、藤原祐一郎、坂田宗平、河合喬文、筒井秀和、大河内善史
  • 学会等名: Neuro2013
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 20130620-20130620
• [学会発表] Crystal Structure of AnkyrinG: the Ion Channel Anchoring Protein (2013)
  • 著者名/発表者名: Fujiwara Y., Okamura Y.
  • 学会等名: Neuro2013
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 20130620-20130620