繊維芽細胞から造血幹細胞へのリプログラミング技法

2012 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 23659202
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 伊藤 克彦 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90281097)
• 研究分担者: 宮地 均 京都大学, ウイルス研究所, 専門技術職員 (90599200)
• キーワード: リプログラミング / 造血幹細胞

研究概要

平成２４年度には、以下の事を行った。
（１）平成２３年度に同定した、造血幹細胞様の培養細胞に特異的に発現する転写因子群をリプログラムに必要な候補遺伝子として、レトロウイルス・ベクターに組み込み、そのウイルス・ベクター産生の最適化を行った。
（２）平成２３年度には、Greenらにより解析されたSCL遺伝子の転写制御領域とEGFPを含む配列を導入したマウスの系統を作成したが、マウス骨髄中のc-Kit陽性・Sca-1陽性・lineage陰性細胞群（KSL細胞）でのEGFPの発現が確認出来る系統を得る事が出来ず、更に、flox-CAGプロモーターを更に入れた配列を導入したマウスの系統でも、同様にKSL細胞でのEGFPの発現が確認出来なかった。このため平成２４年度は、マウスSCL遺伝子を含むBAC（Bacterial artificial chromosome）クローンを得て、このSCL遺伝子の第二エクソン領域をflox-CAGプロモーター、及びEGFPとNeoRを含む配列に置き換えたクローンを作成し、このクローンが導入されたマウスを得た。このマウスの中から、安定して継代可能な、独立した２系統が得られた。
（３）Grafらの作製したVav-Creマウス系統と、上記のマウスの系統を掛け合わせてKSL細胞を含む造血系統の細胞でのEGFPの発現を調べる準備をしている。
（４）また、CAG-Creマウス系統と、上記のマウスの系統を掛け合わせた胎児より、胎児繊維芽細胞の作成を始めた。

現在までの達成度 (区分)

4: 遅れている

理由

Greenらにより詳細に解析されたSCL遺伝子の転写制御領域を用いて、KSL細胞でのレポーター遺伝子の特異的発現を目指したマウスにおいて、KSL細胞でのレポーターの発現が確認出来る系統が得られなかった。
そのため、マウスSCL遺伝子をコードする領域をレポーター遺伝子を含む配列に置き換えたBACクローンを作成し、このBACクローンを導入したマウスの系統を作成した。予定していたしたトランスジェニックマウスの作成が遅れたため、このマウスの胎児繊維芽細胞を用いた候補遺伝子のスクリーニングが行えなかった。

今後の研究の推進方策

平成２４年度に、マウスSCL遺伝子の第二エクソン領域をflox-CAGプロモーター、及びEGFPとNeoRを含む配列に置き換えたBACクローンが導入され、安定して継代可能な、独立した２系統が得られた。このマウスの系統と、CAG-Creマウス系統とを掛け合わせた胎児より、胎児繊維芽細胞の作成を始めている。この細胞に、既に準備した候補遺伝子を発現させる事で、候補遺伝子のスクリーニングを行うことで、研究を推進させる。

次年度の研究費の使用計画

次年度に、以下のことを行う。
（１）上記のBACクローンを導入したマウスより胎児繊維芽細胞を準備し、既に準備した候補遺伝子を発現させる事で、候補遺伝子のスクリーニングを行う。
（２）候補遺伝子の導入で、胎児繊維芽細胞より造血要細胞へと変換された細胞を得られれば、その細胞の造血細胞系統への分可能の検証、可塑性の検証を行う。

研究成果

• [雑誌論文] Light-induced silencing of neural activity in Rosa26 knock-in mice conditionally expressing the microbial halorhodopsin eNpHR2.0. (2013)
  • 著者名/発表者名: Imayoshi, I., S. Tabuchi, K. Hirano, M. Sakamoto, S. Kitano, H. Miyachi, A. Yamanaka, and R. Kageyama
  • 雑誌名: Neuroscience Research 巻: 75 ページ: 53-58
  • DOI: 10.1016/j.neures.2012.03.008
  • 査読あり
• [雑誌論文] HTLV-I Tax regulates the cellular proliferation through the down-regulation of PIP3-phosphatase expressions via the NK-kB pathway. (2012)
  • 著者名/発表者名: Fukuda RI, Tsuchiya K, Suzuki K, Itoh K, Fujita J, Utsunomiya A and Tsuji T
  • 雑誌名: Int. J. Biochem. Mol. Biol. 巻: 3 ページ: 95-104
  • 査読あり
• [雑誌論文] Stromal factors SDF1a, sFRP1, and VEGFD induce dopaminergic neuron differentiation of human pluripotent stem cells. (2012)
  • 著者名/発表者名: Schwartz CM, Tavakoli T, Jamias C, Park C-C, Maudsley S, Martin B, Phillips TM, Yao PJ, Itoh K, Ma W, Rao MS, Arenas E and Mattson MP
  • 雑誌名: J. Neurosci. Res. 巻: 90 ページ: 1367-1381
  • DOI: 10.1002/jnr.23064
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cold-inducible RNA-binding protein (Cirp) interacts with Dyrk1b/Mirk and promotes proliferation of immature male germ cells in mice. (2012)
  • 著者名/発表者名: Masuda T, Itoh K, Higashitsuji H, Higashitsuji H, Nakazawa N, Sakurai T, Liu Y, Tokuchi H, Fujita T, Zhao Y, Nishiyama H, Tanaka T, Fukumoto M, Ikawa M, Okabe M and Fujita J
  • 雑誌名: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 巻: 109 ページ: 10885-10890
  • DOI: 10.1073/pnas.1121524109
  • 査読あり
• [雑誌論文] In situ differentiation of CD8αα T cells from CD4 T cells in peripheral lymphoid tissues. (2012)
  • 著者名/発表者名: Nambu Y, Hayashi T, Jang KJ, Aoki K, Mano H, Nakano K, Osato M, Takahashi K, Itoh K, Teramukai S, Komori T, Fujita J, Ito Y, Shimizu A and Sugai M
  • 雑誌名: Sci. Rep. 巻: 2 ページ: 642
  • DOI: 10.1038/srep00642
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification of a novel enhancer that binds Sp1 and contributes to induction of cold-inducible RNA-binding protein (cirp) expression in mammalian cells. (2012)
  • 著者名/発表者名: Sumitomo Y, Higashitsuji H, Higashitsuji H, Liu Y, Fujita T, Sakurai T, Candeias M, Itoh K, Chiba T and Fujita J
  • 雑誌名: BMC Biotechnology 巻: 12 ページ: 72
  • DOI: 10.1186/1472-6750-12-72
  • 査読あり
• [雑誌論文] Overexpression of gankyrin in mouse hepatocytes induces hemangioma by suppressing factor inhibiting hypoxia-inducible factor-1 (FIH-1) and activating hypoxia-inducible factor-1. (2012)
  • 著者名/発表者名: Liu Y, Higashitsuji H, Higashitsuji H, Itoh K, Sakurai T, Koike K, Hirota K, Fukumoto M and Fujit J
  • 雑誌名: Biochem. Biophys. Res. Commun. 巻: 432 ページ: 22-27
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2013.01.093
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification of IL-7-producing cells in primary and secondary lymphoid organs using IL-7-GFP knock-in mice. (2012)
  • 著者名/発表者名: Hara, T., S. Shitara, K. Imai, H. Miyachi, S. Kitano, H. Yao, S. Tani-Ichi, and K. Ikuta
  • 雑誌名: Journal of Immunology 巻: 189 ページ: 1577-1584
  • DOI: 10.4049/jimmunol.1200586
  • 査読あり
• [雑誌論文] In vivo evaluation of PhiC31 recombinase activity in transgenic mice. (2012)
  • 著者名/発表者名: Imayoshi, I., K. Hirano, S. Kitano, H. Miyachi, and R. Kageyama
  • 雑誌名: Neuroscience Research 巻: 73 ページ: 106-114
  • DOI: 10.1016/j.neures.2012.02.008
  • 査読あり
• [雑誌論文] A multifunctional teal-fluorescent Rosa26 reporter mouse line for cre- and flp-mediated recombination. (2012)
  • 著者名/発表者名: Imayoshi, I., K. Hirano, M. Sakamoto, G. Miyoshi, T. Imura, S. Kitano, H. Miyachi, and R. Kageyama.
  • 雑誌名: Neuroscience Research 巻: 73 ページ: 85-91
  • DOI: 10.1016/j.neures.2012.02.003
  • 査読あり
• [雑誌論文] Role of hepatocyte-derived IL-7 in maintenance of intrahepatic NKT cells and T cells and development of B cells in fetal liver. (2012)
  • 著者名/発表者名: Liang, B., T. Hara, K. Wagatsuma, J. Zhang, K. Maki, H. Miyachi, S. Kitano, C. Yabe-Nishimura, S. Tani-Ichi, and K. Ikuta
  • 雑誌名: Journal of Immunology 巻: 189 ページ: 4444-4450
  • DOI: 10.4049/jimmunol.1201181
  • 査読あり