| 研究課題/領域番号 |
23659324
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
藤田 博美 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60142931)
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| 研究分担者 |
若尾 宏 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10280950)
小田 淳 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (50255436)
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| 研究期間 (年度) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| キーワード | NKT細胞 / さる胚性幹細胞 / レンチウイルスベクター / T細胞分化誘導 |
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| 研究概要 |
ヒトNKT細胞特異的T 細胞抗原受容体 (TCR)cDNAをレンチウイルスベクターにのせてサル（コモンマーモット）の胚性幹細胞(ES細胞)に遺伝子導入し、これら細胞をT細胞分化誘導条件下にて培養しFACS解析をおこなった。まず、ヒト末梢血から抗ヒトVα24抗体を利用してMACSカラムにて濃縮した細胞からRNAを調整し、ヒトNKT細胞特異的TCR cDNA(Vα24-Jα18-Cα)をPCRにて作製した。PCR産物のDNA配列を確認後、このコンストラクトをself inactivating lentivirusベクターにサブクローニングして、コモンマーモットES細胞にtransductionを行なった。この時、ウイルスとES細胞との接触・感染を亢進させるため8μg/ml polybreneを使用した。血清の入らない培地にて37°C,5% CO2,7時間transduction後、polybreneを含まない血清入りの培養液に変えて更に48時間培養した。その後、プロマイシンを添加して2週間培養した。プロマイシン耐性株を幾つか取得し、これをT細胞分化誘導条件下で培養し、NKT細胞が産生されるか否かを調べた。まず、遺伝子組み換えES細胞をフィーダー細胞であるOP9上で培養し、血液幹細胞マーカーCD34を発現する細胞をMACSカラムにて濃縮した。その後、これらCD34+細胞をNotchのリガンドであるdelta-like 1を発現するOP9/dの上で更に3週間培養し、FACS解析を行なったところ、未熟T細胞マーカーであるCD4, CD8両方の発現が観察された。しかしながら、このように分化誘導された細胞を抗ヒトVα24抗体にて染色しても、ポジティブに染まっている細胞は存在しなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
初年度の研究により霊長類胚性幹細胞へのレンチウイルスを使用した遺伝子導入が可能となった。また、遺伝子導入された細胞のT細胞への分化能も維持されているようであった。これで当初目標の半分は到達したといえる。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は目的遺伝子を如何に高発現させるかが、本研究の課題となる。当該目的cDNAの発現を制御しているプロモーターとしてT細胞特異的に発現するlyn等のプロモーターの使用も考慮する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
細胞培養のための関連試薬、プラスチック消耗品等に800千円使用する。 ES細胞から分化誘導したT細胞の細胞表面抗原解析のためのモノクローナル抗体に400千円を使用する。 成果発表・情報収集のための学会出席費用として200千円、計1,400千円の使用を予定している。 なお平成23年度未使用額については、平成23年度に行った印刷の消耗品の支払に使用する。
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