| 研究課題/領域番号 |
23659666
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
伊達 洋至 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60252962)
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| 研究分担者 |
黄 政龍 公益財団法人田附興風会, その他部局等, その他 (10271511)
園部 誠 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (00432378)
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| キーワード | ＦＧＦＲ / ｓｈＲＮＡ / アデノウィルス / ベクター / 遺伝子治療 |
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| 研究概要 |
我々は肺扁平上皮癌に対する新しい治療として，FGFR抑制ベクターによる癌遺伝子治療の研究を行っている．まず我々は非小細胞肺癌におけるFGFR familyの発現に関する包括的臨床的解析を行った．FGFR family遺伝子の全4種類（FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4）について，その遺伝子発現量をreal-time RT-PCRで定量した．その結果，FGFR1の遺伝子発現はEGFR遺伝子とKras遺伝子がともに野生型である肺癌で有意に高かった．また，FGFR2の遺伝子発現もEGFR遺伝子とKras遺伝子がともに野生型である肺癌で有意に高かった．更にFGFR2は，腺癌と比べて扁平上皮癌で有意に遺伝子発現量が高かった（投稿中）．これらの結果は，免疫組織学法による蛋白発現でも同様な所見がえられた．そのため，我々はFGFR1だけでなくFGFR2も肺癌における治療ターゲットになりうると考え， FGFR2発現抑制ベクターをアデノウィルスベクターで作製した．まず合成shRNAをRNA polymerase III系プロモーターを搭載したプラスミドベクターに組込み，shRNA発現プラスミドベクターを作製し，COS-TPC法でshRNA発現アデノウィルスベクター(Ad-shFGFR2)を作製した．そしてこのAd-shFGFR2を用いて，FGFR2高発現肺癌細胞株A549に対してin vitroの遺伝子治療実験を行った．Ad-shFGFR2により遺伝子発現と蛋白発現でFGFR2に対して約85％のノックダウン効率を認めた．しかしながら，MTTアッセイでは，このAd-shFGFR2による腫瘍細胞増殖抑制効果は未だ十分とは言えなかった．そのため現在我々は更に強力なFGFR2発現抑制ベクターを作成に取り組んでいる．同時に，FGFR1発現抑制ベクターの作成にも取り組んでいる．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでの実験成果により，H520がFGFR1高発現肺癌細胞株であり，A549がFGFR2高発現肺癌細胞株であることが判明しており，in vitro及びin vivoの遺伝子治療実験に使用するモデル細胞は既に確立している．更に，我々はこれまでshRNA発現アデノウィルスベクターの作成に精力的に取り組んでおり，技術的には習熟している．そのため，本研究計画の目標であるFGFR発現抑制ベクターの作成は，必ず完成できると考えている．
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| 今後の研究の推進方策 |
今後も我々は更に強力なFGFR2発現抑制ベクターを作成し，in vitro及び in vivoの遺伝子治療実験を行ってゆく予定である．そして，FGFR2高発現癌細胞株に対して，FGFR2抑制ベクターによるin vitro遺伝子治療実験を行う．real-time RT-PCRによるFGFR遺伝子発現定量とWestern BlotによるFGFR蛋白発現定量によりノックダウン効率を評価する．そして，MTTアッセイによる腫瘍細胞障害性定量と，フローサイトメーターによる細胞周期解析により，FGFR2抑制ベクターの抗腫瘍効果を評価する．更に実験動物におけるin vivo遺伝子治療実験も精力的に行う．ヌードマウスに，FGFR2高発現癌細胞株または外科的切除腫瘍組織を移植し，担癌モデルの作製を作製する．ベクター投与法としては，まず腫瘍内への直接注入法を，次に気道内吸入法を検討する．real-time RT-PCRによる標的遺伝子発現の定量と免疫組織化学法とWestern Blotによる標的蛋白発現の定量により，FGFR2抑制ベクターのノックダウン効率の評価する．そして，腫瘍体積の定時的測定，免疫組織化学法によるKi67増殖指数と血管新生の評価，TUNEL法によるアポトーシス評価などを行い，更に肺・肝臓への遠隔転移や生命予後の検討も行い，FGFR2抑制アデノウィルスベクターによる抗腫瘍効果を総合的に評価する．そして，ELISAによるサイトカイン発現定量で生化学的・免疫学的評価も行い，臨床応用可能なFGFR2抑制アデノウィルスベクターの開発を目指してゆく．
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| 次年度の研究費の使用計画 |
該当なし
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