2012 年度実施状況報告書

結合組織マトリックスタンパクの質量解析の確立

研究課題

研究課題/領域番号	23659727
研究機関	徳島大学
研究代表者	佐藤紀徳島大学, 大学病院, 医員 (00448333)
研究分担者	安井夏生徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 教授 (00157984) 東野恒作徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 助教 (80380129) 合田有一郎徳島大学, 大学病院, 医員 (70581148)
キーワード	細胞外マトリックス / コラーゲン / エラスチン / 質量解析 / 不溶性
研究概要	本研究の目的は、今まで不可能と言われていた結合組織マトリックスタンパクの質量解析を確立することである。腱と靭帯など結合組織のマトリックスは巨大分子の集合であるため、不溶性である。そのため、従来のタンパク解析方法では、組織が完全に可溶化されず、成分解析を十分に行うことが出来なかった。結合組織疾患の病態把握には、マトリックスタンパクそのものの解析を行う必要があると考え、本研究の着想を得た。本研究では、化学物質や複数のタンパク分解酵素を段階的に用いることにより、ヒト組織の完全可溶化に成功し、さらに、質量解析の手法を用いて、可溶化したサンプル（断片化したペプチド）から親分子であるタンパク質の検出にも成功した。手術時に得られたヒトの腱（アキレス腱）・靭帯（黄色靭帯）を用いて、上記の方法を確立し、種々のコラーゲンやエラスチン、プロテオグリカン（バーシカン、ビグリカン、フィブロモデュリン等）、接着性タンパク質（フィブロネクチン、ラミニン、インテグリン等）の検出に成功した。日本において正常なヒトの組織の採取は非常に困難であったため、前年度はウサギの腱・靭帯の解析を行い、種々のコラーゲン類やエラスチン等を検出することに成功した。当該年度は、手術時に得られた病的な腱・靭帯（疾患群）を完全可溶化し、質量解析にて構成タンパクを同定する予定であった。特に、当大学病院においては、腰部脊柱管狭窄症における肥厚した黄色靭帯を採取できる機会が多いため（当大学倫理審査委員会にて承認済み）、腰部脊柱管狭窄症を中心に構成タンパクを同定し、病態の主座をつきとめる予定であったが、当該年度は産前産後及び育児休業の取得に伴う中断により、実施できていない。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 4: 遅れている理由産前産後休暇及び育児休業の取得に伴い、1年間研究を中断したため。
今後の研究の推進方策	腱・靭帯の可溶化および質量解析に成功したため、引き続き、ヒト腱・靭帯（疾患群）のタンパク解析を行う。手術時に得られた病的な腱・靭帯（疾患群）を完全可溶化し、質量解析にて構成タンパクを同定する。とくに、当大学病院においては、腰部脊柱管狭窄症における肥厚した黄色靭帯を採取できる機会が多いため（当大学倫理審査委員会にて承認済み）、腰部脊柱管狭窄症を中心に構成タンパクを同定し、病態の主座をつきとめる。また、同定したタンパクの中でも、とりわけ病態把握に関与しているであろうと推定したタンパクを中心に、その局在を組織学的に検証（光学顕微鏡および電子顕微鏡）し、病態について考察する。
次年度の研究費の使用計画	①当該研究費が生じた状況産前産後休暇及び育児休業の取得に伴い、1年間研究を中断したため。 ②翌年度以降に請求する研究費とあわせた使用計画既に採取済みの腰部脊柱管狭窄症における肥厚した黄色靭帯を用いて、構成タンパクを同定するために必要な試薬（質量解析試薬、タンパク分解酵素、免疫染色試薬等）、実験器具（質量解析用カラム等）、国内旅費（学会発表等）、質量解析装置使用料、論文作成のための翻訳・校閲のための費用を要す予定である。