研究概要 |
角膜上皮への接着糖蛋白と考えられているアカントアメーバのMannose Binding Protein1(MBP1)が結合する角膜の糖蛋白を同定するため、MBP1細胞外N-domainとC-domainのGST結合蛋白の精製無細胞蛋白合成のコンストラクトpEU-E01-MBPNC-TEV-GST (NC), pEU-E01-MBPN-TEV-GST (N)及びpEU-E01-MBPC-TEV-GST (C)を作成した。SV40T antigen不死化ヒト角膜上皮細胞から細胞膜分画抽出キットで細胞膜分画を分離し、3つのコンストラクトから得られたMBPNC-GST、MBPN-GST、MBPC-GSTと反応させたのちSDS-PAGEで展開し、MBPNC-GST、MBPN-GSTのみに存在するバンドをMALDI-TOF/MSで解析した。KRT1 Keratin, type II cytoskeletal 1、 KRT9 Keratin, type I cytoskeletal 9、 KRT10 Keratin, type I cytoskeletal 1、 Keratin-8-like protein 1、 ACTB 14 kDa protein ACTG1 cDNA FLJ57283, highly similar to Actin, cytoplasmic 2 、HRNR HornerinがMBP1のN-domainと接着していることが解った。蛍光標識アカントアメーバの作成では、CAG,CMV,pgkなどの真核生物で働くプロモーターは働かないことを確認した。そこでアカントアメーバのユビキチンのプロモーターと考えられる1.7kbの領域を人工遺伝子合成してtdTomatoの発色を検討したところ、数日間細胞質に蛍光を観察することができた。
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