| 研究課題/領域番号 |
23659832
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
石河 利広 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10402869)
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| 研究分担者 |
鈴木 茂彦 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30187728)
内藤 素子 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (30378723)
吉川 勝宇 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10583156)
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| 研究期間 (年度) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| キーワード | 巨指症 |
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| 研究概要 |
巨指症患者に対する手術療法のうち、主なものは減量手術である。指長の短縮、指幅の縮小のために皮下脂肪や骨を切除することが多い。この手術を受ける患者で、インフォームドコンセントを十分に得た方から、脂肪組織、骨膜を採取した。病変部および正常対象の脂肪組織より脂肪幹細胞を単離、培養した(Zuk PA et al. Tissue Eng 7:211-228. 2001)。脂肪組織をPBSにて洗浄後、0.075% collagenaseで37℃、30分インキュベートした。その後、10%FCS入DMEMにてcollagenaseを中和した。1500rpmで10分間遠心分離し、得られた細胞ペレットを75cm2の培養フラスコに移して培養した。24時間後に接着していない細胞を取り除いた。細胞を抗真菌剤入りの培養液で7日間培養した。その間、2,3日おきに培養液を交換した。その後は、抗真菌剤なしの培養液で培養し、3日おきに培養液を交換した。細胞は、confluentに達する前に継代した。得られた脂肪肝細胞をもちいてcolony assayを行った。脂肪肝細胞を10cm dish 1枚あたり、1000個、5000個、10000個播種する群にわけ3週間培養を行った。3週間後にギムザ染色を行い10cm dish 1枚あたりのcolonyの数、大きさを測定した。病変部より採取した脂肪肝細胞の旺盛な増殖能を確認できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
インフォームドコンセントを得られた患者のうちの1名がインフルエンザに罹患し昨年度手術予定が今年度5月に手術予定が延期となっているため、採取検体がそろうのが遅延している。
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| 今後の研究の推進方策 |
採取検体がそろい次第、巨指症病変部および正常対象の脂肪、骨膜よりtotal RNAを抽出し、マイクロアレイ解析により網羅的に遺伝子発現プロファイルを検討する。病変部と正常対象との間で発現の差のある遺伝子の中から巨指症に特異的な発現を示す遺伝子候補を決定する。ノーザンブロット、in situ hybridizationによりマイクロアレイ解析で得られた巨指症に特異的な発現を示す遺伝子候補の発現や組織での局在を確認する。また、タンパク質レベルでの発現も、免疫組織化学的染色により確認し、巨指症に特異的に発現を示す遺伝子を同定する。また、病変部より得られた脂肪幹細胞と正常脂肪組織より得られた脂肪肝細胞のcolony assay、MTT assayの比較を行い増殖能にて検討したり、ヌードマウスに移植してin vivoの細胞の増殖、局在等を確認する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
１）症例数の増加をはかる。２）病変部および正常組織から採取した骨芽細胞、脂肪肝細胞をNEO STEM(Biterilas社）を用いRITCにてラベルする、ヌードマウスに移植してin vivoでの細胞動態を調べる。３）ノーザンブロット、in situ hybridizationによりマイクロアレイ解析で得られた巨指症に特異的な発現を示す遺伝子候補の発現や組織での局在を確認する。また、タンパク質レベルでの発現も、免疫組織化学的染色により確認し、巨指症に特異的に発現を示す遺伝子を同定する。
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