| 研究課題/領域番号 |
23686118
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
浅野 竜太郎 東北大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (80323103)
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| 研究期間 (年度) |
2011-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 癌 / 蛋白質 / バイオテクノロジー / 二特異性抗体 / ファージ提示法 |
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| 研究概要 |
抗体医薬の併用は特にガン治療に於いて、安全性と治療効果を向上させることができるが、薬価の高さも大きな問題の1つであるため現実的ではない。本提案では、モノクローナル抗体に2つ目の特異性を付加させることで、併用投与と同等以上の効果を発揮する二特異性化抗体の開発を目指すと共に、申請者が開発してきた、二重特異性抗体と統合させることで、さらに付加価値の高い新世代治療抗体を創製することを目的としている。
本年度は、前年度に引き続きEGFRとErbB3の両者に結合する二特異性抗体の創製を進めた。これまでに既存の抗EGFR抗体のVHへの変異導入では有望なクローンは得られなかったため、VLへの変異導入と選択を可能とするために、新たにFv添加型のオープンサンドウィッチ法を開発してきた。まず添加に用いるFvとして、以前単離したEGFRへの結合活性を高めた変異体を選抜し、大腸菌を用いて大量発現させ、精製を行った。続いて、前年度作製したライブラリA(変異導入箇所14、出現アミノ酸種3)に加えて、よりライブラリ規模を担保するため変異導入を10箇所に絞ったライブラリBを調製し、配列解析により多様性を確認した。選択操作は、これら2つのライブラリに加えて、既存のライブラリC(変異導入箇所3、出現アミノ酸種20)を用いて、ErbB3強制発現CHO細胞と正常なCHO細胞をそれぞれ利用した生細胞パニングにより進めた。今後、条件検討も行いつつ、ラウンドを重ねて選択操作を進め、すべてのライブラリに対して網羅的な配列解析を行い、濃縮クローンの単離、機能評価へと進める予定である。一方、取得した二特異性化抗体を用いた二重特異性抗体の作製に向けた基盤技術の整備に向けて、ヒト型化抗CD16抗体を用いたガン治療を目指した組換え抗体の作製と機能評価を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
前年度、抗EGFR抗体のVL変異体ライブラリの作製に際して、溶媒表面に露出している残基を選抜した結果、14箇所が候補として挙げられた。ライブラリ規模を下げるためにバイナリーコードと名付けられているチロシンとセリンの2種のアミノ酸と、EGFRへの結合ホットスポットが存在する可能性を考慮して、バイナリーコードに野生型のアミノ酸を加えた3アミノ酸に絞ったライブラリを作製した。しかしながら必ずしもこれらを完全に満たすミックス塩基が存在しなかったため、1箇所につき理論上最大で6種類のアミノ酸が出現し得る。そこで、本年度は選択操作へと進める前に、よりライブラリ規模を担保するため、変異導入箇所を10箇所に縮小した新たなライブラリの作製から進めた。このため当初計画より選択操作の開始が遅れたが、すべてのアミノ酸種が出現する既存のライブラリも用いて進めたため、より有意義な結果や知見が得られることが期待できる。
一方、ヒト型化抗CD16抗体を用いたガン治療を目指した組換え抗体の作製に関して、別途進めていたヒト型抗CD3抗体を用いたガン治療抗体の開発で得られた結果から、配向性を検討することの重要性が明らかになったため、配向性が異なる分子種も併せて作製することとした。このため、予算を繰り越して研究を進めざるを得なかったが、結果、すべての分子種の発現ベクターの作製に成功し、さらにいずれも大腸菌を用いて調製可能であることが示されたため、今後行うガン細胞傷害性試験等により有益な知見が得られることが期待される。以上の様に、当初の予定から進捗に応じて少し修正しているものの、研究全体としては大きな遅れは生じていないため、おおむね順調に進展しているとした。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、EGFR/ErbB3二特異性抗体に関しては、条件検討も行いつつ、ラウンドを重ねて選択操作を進め、クローンの選抜、機能評価へと進め、ヒト型化抗CD16抗体を用いた二重特異性抗体に関しては、配向性と機能の相関に関する知見の取得を目指す。
特にクローンの選抜に関しては、配列に濃縮がみられたクローンや類似したアミノ酸配列を有するクローンを見出すため、各ライブラリごとに無作為に100クローン程度配列解析を行う予定である。選抜したクローンは、大腸菌発現ベクターへの移し替えを行い、各々形質転換後、試験管培養上清を用いてフローサイトメトリーにより、 ErbB3強制発現CHO細胞、 EGFR強制発現CHO細胞、さらには正常なCHO細胞に対する結合活性を評価する。培地上清中の二特異性抗体の濃度がフローサイトメトリーで評価できる十分な量ではなかった場合は、坂口フラスコ等を用いた培養スケールの拡大やELISAや表面プラズモン共鳴法の利用など、他の解析手法を用いた評価の検討も進める。一方、ヒト型化抗CD16抗体を用いた二重特異性抗体は、前年度までに4種類の配向性を作製しているが、それぞれ結合活性や、ガン細胞傷害活性を評価することで、配向性の影響の詳細な記述を目指す。さらにErbB受容体群を標的とした新たな二特異性抗体の創製を目的に、EGFRとHER2を標的としたEGFR/HER2二特異性抗体の取得も目指していく予定である。
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