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分子の自己組織化あるいは基質結合の分子機構を明らかにするためには、反応に寄与する分子のコンフォメーションや電子状態の変化を実時間観察することが重要である。そこで、化学反応を誘起する方法として、溶液の混合や光照射による手法が開発されてきた。特に溶液の混合によって反応を開始する方法は種々の反応場を提供でき、また様々な測定法と用意に組み合わせることが可能であるという特長がある。しかし、従来の方法では大量の試料を必要とするために対象にできる生体試料が限定されており、時間分解能も数ミリ秒程度が限界である。本申請研究では新規のマイクロ流体連続フローミキサーを開発し、顕微分光法と組み合わせることによって、試料の消費量を抑制し、時間分解能を向上させた新規の計測系を構築することを試みた。平成23・24年度にはミキサーの開発、及び顕微システムを用いた蛍光強度測定・蛍光寿命測定系の構築を進めた。その結果、蛍光観察に適した測定系の構築に成功した。平成25年度からは研究実施場所を理化学研究所に移したことに伴い、研究対象とするタンパク質をヘムと鉄を活性中心とする膜タンパク質である一酸化窒素還元酵素に定め、その反応に伴うコンフォメーション変化を蛍光観察することを試みている。しかし、ヘムは可視領域に強い吸収を持つため、エネルギー移動に伴う消光が大きいことが予想された。そこで、まずはヘムの吸収スペクトル変化を追跡できる計測系を追加で構築することで、一酸化窒素の還元に伴う活性中心の電子状態変化を明らかにした。計測には平成23年度から利用しているマイクロ流路加工技術を転用し、作製したマイクロ流路フローセルを新たに開発し、光照射によって基質を放出するケージド化合物を利用した。これによって、開発したマイクロ流体フローミキサーと同等の時間分解能(30マイクロ秒)を達成できた。
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