| 研究課題/領域番号 |
23687025
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| 研究機関 | 横浜市立大学 |
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研究代表者 |
山下 暁朗 横浜市立大学, 医学部, 講師 (20405020)
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| 研究期間 (年度) |
2011-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | NMD / mRNA分解 / mRNA代謝 / 翻訳終結 |
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| 研究概要 |
平成24年度より当初の研究計画にある研究を進めるとともに、NMDを阻害する低分子量化合物の探索のための、SMG1酵素活性ハイスループットアッセイ系の構築を行った。また、低分子量化合物スクリーニングのため、SMG1酵素の大量精製系を構築し、大量精製を行った。SMG1酵素は、400kDaの巨大分子であり、単体では、スクリーニングにしよう可能な安定性を得られなかったが、SMG1:SMG9(SMG1酵素複合体因子)複合体とすることで、これを解決した。さらに、共同研究によりこれを用いたSMG1阻害剤スクリーニングをおこなっている。さらに、培養細胞ベースのNMD活性のハイスループットアッセイ系についても構築にを行った。これを用いて、共同研究により、低分子化合物スクリーニングを開始しており、NMD阻害剤同定が実現しつつある。また、独自に樹立した動物細胞を用いたタンパク質多量精製系を用いて、NMD制御分子の精製を行い、NMDにおけるmRNA分解過程の試験管内再構築を進めている。これについても、当初の予定以上に解析が進んでおり、興味深い結果が得られつつある。
NMD阻害による癌や遺伝性疾患治療を考えるために、NMD阻害の細胞毒性についても解析を進めた。15種のNMD制御分子について、shRNA発現ベクターや合成siRNAを用いたノックダウン解析を進め、SMG-8のノックダウンが最も細胞毒性とNMD阻害のバランスが優れていることを明らかとした。
新規のNMD制御因子を同定するため、SMG5, SMG6, SMG7の結合蛋白質の同定をすすめている。平成24年度は、安定発現細胞株の取得と、スモールスケールの解析を行い、いくつかの新規結合タンパク質を取得している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
NMDの阻害によるガン細胞の増殖阻害について、低分子量化合物の探索を行うことは、研究成果の社会還元を考える上で重要である。平成24年度より当初の研究計画にある研究を進めるとともに、低分子量化合物の探索のための、アッセイ系の構築とそれを用いたNMD阻害剤スクリーニングをおこなった。これについて、ヒトNMDの中心分子の一つであるタンパク質リン酸化酵素SMG1のハイスループットアッセイ系の構築に成功した。さらに、培養細胞ベースのNMD活性のハイスループットアッセイ系についても構築に成功した。これらを用いて、共同研究者が、低分子化合物スクリーニングを開始しており、NMD阻害剤同定が実現しつつある。また、独自に樹立した動物細胞を用いたタンパク質多量精製系を用いて、NMD制御分子の精製を行い、NMDにおけるmRNA分解過程の試験管内再構築を進めている。これについても、当初の予定以上に解析が進んでおり、興味深い結果が得られつつある。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在順調に研究が推移している。現在行っている研究を進めていく。また、SMG5, SMG6, SMG7の結合蛋白質について、大きな実験スケールの解析を行う。さらに、培養細胞ベースのNMD活性のハイスループットアッセイ系について改良を進める。
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