| 研究課題/領域番号 |
23688015
|
|---|
| 研究機関 | 名古屋大学 |
|---|
研究代表者 |
近藤 竜彦 名古屋大学, 生命農学研究科, 助教 (30362289)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2011-11-18 – 2015-03-31
|
| キーワード | ペプチドホルモン / 気孔 / stomagen / EPF family |
|---|
| 研究概要 |
(a) EPFペプチド類の構造活性相関研究
前年度の成果報告書に述べたとおり、構造活性相関研究は停止したが、本研究で培ったEPFペプチドの合成法を生かしてEPFL5（CLL1）の合成に取り組み、化学合成により生理活性を有するペプチドを得ることに成功した。また、プロテアーゼ処理で得られるペプチド断片の構造解析により、EPFL5もstomagenと同様の様式でジスルフィド結合を形成していることを明らかにした。
(b) EPFファミリーペプチドの網羅的解析
シロイヌナズナ以外の植物体内におけるEPFファミリーペプチドの機能について検討した。ハクサイはstomagenホモログ遺伝子を1個有し、その配列はシロイヌナズナstomagenと完全に相同である。ハクサイの子葉に対してstomagenを処理した結果、100nM以上の濃度で気孔密度の上昇と気孔の隣接というシロイヌナズナと同様の表現型が誘導されたことから、stomagenの機能はハクサイでも保存されていることが明らかになった。一方でダイズに対しては様々なペプチド添加法を検討したがstomagenの生理活性を観察することはできなかった。また、ウサギを免疫して作成した抗stomagen抗体を用いた免疫沈降により、ハクサイおよびダイズの葉から調製したアポプラスト抽出液中にはシロイヌナズナと同様に45残基からなるstomagenペプチドが存在することを明らかにした。
(c) stomagen受容体の探索
前年度合成した光アフィニティプローブとシロイヌナズナ幼葉の表皮を用いてラベル実験を行った結果、約60kDaと約120kDaのタンパク質がラベルされた。そこでこのタンパク質の精製法について種々の検討を行い、ゲル濾過HPLCおよび抗Alexa488抗体を用いた免疫沈降により効率よく目的タンパク質を精製する手法を確立した。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の長期的目標の一つは、stomagenおよびEPFファミリーペプチドによる表皮上の気孔密度調節を通して、耐乾燥性などの機能性植物を作出することにある。今年度の研究から、シロイヌナズナに比較的近縁なハクサイおよびダイズの植物体内でも45残基からなるstomagen成熟型ペプチドが生産されていることが明らかになり、ハクサイに対してはstomagenが気孔密度を上昇させることを示した。これまでにシロイヌナズナ以外の植物でstomagenが機能することを示した報告はなく、この新規な知見は先に述べた長期的目標達成のための重要な一歩であると考えている。
また、stomagen受容体の同定への取り組みに関しては、今年度の研究によって光アフィニティラベリング法により、受容体候補タンパク質の検出に成功し、抗Alexa488抗体を用いた免疫沈降という特異性の高い精製法を利用することで、非常に効率よく目的タンパク質を精製することに成功した。最終段階のSDS-PAGEにおける目的タンパク質の蛍光輝度を市販のAlexa488ラベルタンパク質と比較した結果、シロイヌナズナ幼葉400枚を精製出発原料として数十fmolの目的タンパク質を得ることができたと推定される。予備的にin-gel digestionを行って目的タンパク質の酵素消化断片を得てMALDI-TOFMSで解析した結果、目的タンパク質に由来する2本のシグナルが観測された。しかし、この情報だけでは受容体の同定には至らなかったことから、精製出発原料の量上げを行い、酵素消化断片の情報を増やすことで、25年度中にはstomagen受容体の同定という目標を達成したいと考えている。以上の結果から、当初の研究目的に照らして、おおむね達成することができたと考える。
|
| 今後の研究の推進方策 |
EPFファミリーペプチドの網羅的解析に関しては、今年度の研究からハクサイではstomagenが生理活性を示すことが明らかになった。一方でダイズではstomagenの活性を観察することができなかった。抗stomagen抗体を用いた免疫沈降の結果から、ダイズ植物体内でも45残基からなる成熟型stomagenが存在すること示されたことから、ダイズにおいて内生のstomagenが機能していないことは考えにくく、stomagenの添加法や添加時期など実験条件の問題が大きいと考えている。また、ダイズはシロイヌナズナやハクサイに比べて植物体が大きく、それに比例して大量のペプチドが必要となる点が問題であった。これらの問題を解決するために、インターロイキンなどの分泌生産に実績のあるBrevibacillusを用いた発現系によるEPFペプチドの分泌生産について検討を行う予定である。Brevibacillusは分泌型タンパク質を構成的に発現することから、生理活性を有するEPFペプチドを高い効率で得られる可能性があることに加えて、組換えBrevibacillusを植物体に感染させることで、比較的大きな植物体でも、全体的かつ恒常的にEPFペプチドで植物体を刺激する手法を確立できる可能性がある。
また、stomagen受容体の同定に関しては、光アフィニティラベリングによりラベルする手法、ラベルされたタンパク質の精製法およびin-gel digestionによる酵素消化断片の調製と解析に至る手法についての検討を完了したので、精製出発原料の量上げを行うことにより目的タンパク質の同定を目指す。またこれと並行して、stomagenが機能することが明らかになったハクサイの子葉（シロイヌナズナ幼葉よりも数倍から数十倍大きい）を用いて同様の実験を行うことで、量上げと同様の効果が期待できると考えている。
|
