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2013 年度 実施状況報告書

癌幹細胞を標的治療するCD133反応性増殖型アデノウイルスの開発

研究課題

研究課題/領域番号 23701062
研究機関鹿児島大学

研究代表者

王 宇清  鹿児島大学, 産学官連携推進センター, プロジェクト研究員 (20505143)

キーワード腫瘍生物学 / 癌幹細胞 / 遺伝子治療 / アデノウイルスベクター / 国際研究者交流
研究概要

本研究の目的は、治療抵抗性の原因となる癌幹細胞を標的として、同定・診断・治療可能な増殖制御型アデノウイルスベクターを構築、検証するものであって、本課題は以下の3点について明らかにする予定。① 癌幹細胞の表面マーカーと報告されたCD133が真の癌幹細胞マーカーであることの確認。② 癌幹細胞の細胞学的・遺伝子学的特徴の解明。③ 癌幹細胞に標的治療する増殖制御型アデノウイルスベクター(CD133反応性m-CRA)の構築と検証。
平成23年度から研究計画通りに以下のことを進めてきた。① CD133の発現に制御するプロモーター活性を解析するため、五つのプロモーターをクローニングし、非増殖型アデノウイルスベクターに組み込むことができた。② それを用いて、CD133高発現する消化器癌細胞株と臨床グリオブラストーマから浮遊細胞塊形成法で濃縮してきた神経癌幹細胞におけるCD133プロモーターの制御活性を解析し、癌細胞より癌幹細胞にはCD133のプロモーター活性が顕著に高いと示された。③ CD133遺伝子発現癌幹細胞をターゲッティングする増殖型アデノウイルスベクター(CD133反応性m-CRA)を構築した。④ CD133反応性m-CRAを用いて、各種のCD133発現する癌細胞株と癌幹細胞に感染し、in vitroの治療効果を検証できた。CD133発現癌細胞株と癌幹細胞にCD133反応性m-CRAは有意な癌細胞と癌幹細胞の殺傷効果が示された。一方、正常細胞にCD133反応性m-CRAの毒性が見られなくて、in vitroの安全性も示された。⑤ さらに、NOD-SCID免疫不全マウスを用いて、癌幹細胞の腫瘍形成能を確認し、ex vivoの実験でCD133反応性m-CRAの腫瘍抑制作用の検証実験を進めることができた。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究は癌幹細胞を標的治療する増殖制御型アデノウイルス(CD133反応性m-CRA)の構築と治療効果の検証を行い、それによって、固体癌の癌幹細胞表面マーカーCD133は真の癌幹細胞のマーカーであることと、癌幹細胞の細胞学的・遺伝子学的特徴を明らかにするという3つの目的の達成を目指す。
研究の進行は以下の通りに進めてきた。平成23年度 ① CD133の発現に制御するプロモーターの活性解析を行うため、クローニングしたCD133の5種類のプロモーターをまず非増殖型アデノウイルスベクターに組み込むことができた。② それを用いて、CD133高発現する消化器癌細胞株と臨床グリオブラストーマから浮遊細胞塊形成法(Sphere法)で濃縮してきた神経癌幹細胞におけるCD133プロモーターの制御活性を解析した。がん細胞より癌幹細胞にはCD133のプロモーター活性が顕著に高いと示す。平成24年度 ① CD133遺伝子発現癌幹細胞をターゲッティングする増殖型アデノウイルスベクター(CD133反応性m-CRA)を構築した。② CD133反応性m-CRAを用いて、各種のCD133発現する癌細胞株と癌幹細胞に感染し、in vitro治療法を検証した。CD133発現癌細胞株とCD133発現する癌幹細胞にCD133反応性m-CRAは有意な癌細胞と癌幹細胞の殺傷効果が示された。③ 一方、正常細胞にCD133反応性m-CRAの毒性が見られなくて、in vitroの安全性が示された。平成25年度 動物レベルの検証に入り、NOD-SCID免疫不全マウスを用いて、癌幹細胞の腫瘍形成能を確認し、ex vivoの実験でCD133反応性m-CRAの腫瘍抑制作用の検証実験を行った。平成26年度、ex vivoの実験を継続に進めて行く予定。

今後の研究の推進方策

本研究癌幹細胞を標的治療する増殖制御型アデノウイルス(CD133反応性m-CRA)の構築と検証を行い、それによって、固体癌の癌幹細胞表面マーカーCD133は真の癌幹細胞のマーカーであることと、癌幹細胞の細胞学的・遺伝子学的特徴を明らかにすることなので、これから継続にいくつの癌幹細胞にCD133反応性m-CRAのin vitro殺傷効果とin vivoの治療効果の検証を進めていく予定。
具体的に以下の研究を継続していく予定。
① CD133反応性m-CRAのin vitro治療法の検証について、さらに、各種の癌細胞株と癌幹細胞のCD133(+)分画とCD133(-)分画の間で、in vitroでFlow Cytometry解析とWST assayなどの生存細胞解析方法でCD133(+)細胞特異的と癌幹細胞の標的の治療効果を検証する。② 上記①のCD133反応性m-CRAのin vivo治療効果の検証。③ 本研究室開発したm-CRAの作製法で、治療遺伝子(P2)の部分(作製法は本研究計画書に参考)にCD133反応性m-CRAのP2の部分にあるEGFPによりCD133(+)癌細胞と癌幹細胞を殺す以外は、治療経過の可視化も可能となり、それについての検証も行う予定である。④ ex vivoとin vivoで多種類のm-CRAの治療効果を比べる。
本課題「癌幹細胞を標的として同定・診断・治療可能な増殖制御型アデノウイルスベクターの構築と検証」については、平成25年度まで研究計画通りに進めてきて、実験材料や実験条件、技術の準備は整っており、平成26年度は既に始まっている上記の動物実験について、継続的に検証していく予定。

次年度の研究費の使用計画

研究の進展に伴い、研究計画書通りに作成したCD133.m-CRAの癌幹細胞への治療効果は、さらにex vivoとin vivoで多種類のm-CRAと比べるために、研究計画を変更することになった。
本研究継続していくため、未使用額はex vivoとin vivoの動物実験の免疫不全マウスの購入、細胞培養、解析用試薬、国内と国際学会発表用交通費、宿泊費、論文投稿に関する印刷費、英文校正費などの費用に使用する予定。

  • 研究成果

    (4件)

すべて 2014 2013

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (2件) 産業財産権 (1件) (うち外国 1件)

  • [雑誌論文] Survivin-responsive conditionally replicating adenovirus kills rhabdomyosarcoma stem cells more efficiently than their progeny.2014

    • 著者名/発表者名
      Tanoue K, Wang Y, Ikeda M, Mitsui K, Irie R, Setoguchi T, Komiya S, Natsugoe S, Kosai K.
    • 雑誌名

      J Transl Med.

      巻: 27 ページ: 12:27

    • DOI

      10.1186/1479-5876-12-27

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [学会発表] Immunohistochemical comparative analysis of the sphere cells of CD133-positive pancreatic cancer cells with iPS cells.2013

    • 著者名/発表者名
      宮崎 優美、王 宇清、三井 薫、丁 強、政 幸一郎、松原 修一郎、小戝 健一郎、高尾 尊身。
    • 学会等名
      第72回日本癌学会学術総会
    • 発表場所
      パシフィコ横浜(横浜)
    • 年月日
      20131003-20131005
  • [学会発表] Survivin-responsive conditionally replicating adenovirus efficiently kills rhabdomyosarcoma-initiating cells: a promising m-CRA strategy for treating cancer stem cells.2013

    • 著者名/発表者名
      王 宇清、田上 聖徳、池田 美奈子、小戝 健一郎等。
    • 学会等名
      がん若手研究者ワークショップ
    • 発表場所
      蓼科グランドホテル滝の湯(長野)
    • 年月日
      20130904-20130907
  • [産業財産権] 癌幹細胞を標的とするウイルスベクター2013

    • 発明者名
      小戝 健一郎、王 宇清
    • 権利者名
      小戝 健一郎、王 宇清
    • 産業財産権種類
      特許
    • 産業財産権番号
      14/007, 227
    • 出願年月日
      2013-09-24
    • 外国

URL: 

公開日: 2015-05-28  

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