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DNA-タンパク質クロスリンク(DPC)は、様々なDNA傷害性因子により誘発される普遍的なゲノム損傷である。申請者は、これまでDPCの遺伝・細胞伝毒性発現の分子機構を明らかにするため、ファージならびに大腸菌をモデルとして転写および複製影響に関する研究を行ってきた。その結果、superbulkyなDPCは、従来のbulkyな損傷とは異なるメカニズムで転写および複製装置を阻害することが明らかとなってきた。本研究では、この研究を発展させ、より高度な転写・複製装置をもつ哺乳類細胞で検討を行う。前年度の研究で、HeLa細胞核抽出物用いたRNAPII試験管内転写系が確立できたことから、本年度は、まずDNA鋳型への新規なDPC導入法を検討した。Click反応を用いてC5 alkyne dTを含むオリゴヌクレオチドとアジド化タンパク質の間で架橋を形成させた。PAGEによる生成物分析の結果、histone、midkineなどが効率よくクロスリンクを形成することがわかった。また、これと並行して、モデル損傷であるfluoresceinを含むDNA鋳型の構築も行った。fluoresceinは、非転写鎖および転写鎖に導入した。fluoresceinを含む鋳型を用いRNAPII転写反応を行い、生成物をPAGE分析した結果、非転写鎖のfluoresceinは転写を阻害しないが、転写鎖のfluoresceinは転写を阻害し、損傷部位で転写が止まった生成物が見られた。この時、runoff転写産物の生成は認められなかった。現在、この試験管内転写系を用いてDPCの転写阻害を調べ、fluoresceinとの相違を検討している。
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