研究課題
本研究の目的は、相同組換えの中心酵素であるRAD51のクロマチン上での組換え反応機構を明らかにすることである。具体的には、①ヌクレオソーム存在下での組換え反応解析系を試験管内で構築すること、②ヌクレオソーム構造の違いがRAD51依存的な組換え反応に及ぼす影響を明らかにすること、③RAD51 活性化因子が、ヌクレオソーム存在下でのRAD51 の組換え活性に及ぼす影響を明らかにすることを研究計画として定めた。本年度は、リンカーヒストンH1に着目し研究を行った。リンカーヒストンH1は、ヌクレオソームに結合し、ヌクレオソームの高次構造形成に重要な役割を担うと考えられている。まず、H1をリコンビナントタンパク質として精製した。精製したH1とクロマチンDNA基質を混合し、H1を含むクロマチン基質を作製した。H1の結合したクロマチンDNA基質を用いて組換え反応を解析したところ、H1存在下においては著しくRAD51及びRAD54の組換え活性が阻害されることが明らかになった。次に、RAD51活性化因子がクロマチン構造上での組換え反応に及ぼす影響について解析した。RAD51の活性化因子として知られるRAD52及びRAD51AP1をリコンビナントタンパク質として精製し、上記にて確立した試験管内再構築系を用いて、これらの因子がRAD51のヌクレオソーム上での組換え活性に及ぼす影響を調べた。解析を行った条件下においては、RAD51AP1及びRAD52のどちらについても組換え反応の活性化は検出できなかった。本研究による解析から、クロマチン構造上での組換え反応を検出する試験管内での再構築系を新たに確立し、クロマチン構造の違いがRAD51及びRAD54による組換え反応に変化を及ぼすことを明らかにした。これにより、クロマチン構造の違いが直接的に相同組換え反応を制御しうることが示唆された。
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Journal of Cell Science
巻: (in press)
Nucleic Acids Research
巻: Vol.40 ページ: 3031-3041
doi:10.1093/nar/gkr1229
