化学修飾型基質を特異的に取り込むＤＮＡメチル化酵素を用いたメチル基継承機構の研究

2012 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 23710251
• 研究機関: 東京医科歯科大学
• 研究代表者: 野村 渉 東京医科歯科大学, 生体材料工学研究所, 准教授 (80463909)
• キーワード: 蛋白質 / 遺伝子 / ゲノム / メチル化 / エピジェネティクス

研究概要

本年度の研究において、分割型DNAメチル化酵素の会合様式に関するカイネティクス解析を詳細に行うために得た精製酵素を用いてCDスペクトルの測定を行った。各分割型ドメインのスペクトル、および混合した場合のスペクトルを比較したところ、C末端ドメイン（MeCD）およびN末端ドメイン（MeND）について、混合時のスペクトルは和を示していた。よって、混合時はそれぞれの分割型ドメインの構造的な変化は起きていないことが明らかになった。この測定条件では標的DNAが存在していないため、分割型DNAメチル化酵素が標的配列に結合したのちに会合をしてメチル化活性を発現するという予測に対する根拠の一つが得られたと考えられる。また、標的とするDNA配列の拡張を行うため、テロメア逆転写酵素のプロモーター配列、ASH1、ATF3各遺伝子のコーディング配列に対して結合するジンクフィンガーの構築を行った。分割型酵素のDNA結合ドメインとして、隣接する配列に結合する2個のジンクフィンガードメインが1対になる。それぞれの標的遺伝子に対して約20対のジンクフィンガードメインを構築し、その中から数―数10 (nM)の高いDNA結合活性を有するジンクフィンガードメインを得ることに成功した。また、哺乳類細胞内において活性を有するメチル化酵素の構築を検討するため、ジンクフィンガードメインとDNAメチル化酵素M.HhaIの融合酵素を構築し、細胞内での発現に関する検討を行った。最初の段階では発現が見られなかったが、ファージ由来のメチル化酵素であるM.HhaIの遺伝子配列についてコドンの最適化を行ったところ、良好な発現が確認された。発現が最適化されたメチル化酵素ドメインを基に分割型メチル化酵素の構築を行うことで、細胞内において配列特異的なDNAメチル化を行うことが可能になり、メチル基の継承に関する知見につながると期待される。

研究成果

• [雑誌論文] CD4 mimics as HIV entry inhibitors: Lead optimization studies of the aromatic substituents. (2013)
  • 著者名/発表者名: Narumi T, Arai H, Yoshimura K, Harada S, Hirota Y, Ohashi N, Hashimoto C, Nomura W, Matsushita S, Tamamura H.
  • 雑誌名: Bioorg. Med. Chem. 巻: 21 ページ: 2518-2526
  • DOI: DOI:10.1016/j.bmc.2013.02.04
• [雑誌論文] Low-molecular-weight CXCR4 ligands with variable spacers. (2013)
  • 著者名/発表者名: Narumi T, Aikawa H, Tanaka T, Hashimoto C, Ohashi N, Nomura W, Kobayakawa T, Takano H, Hirota Y, Murakami T, Yamamoto N, Tamamura H.
  • 雑誌名: ChemMedChem 巻: 8 ページ: 118-124
  • DOI: DOI:10.1002/cmdc.201200390
• [雑誌論文] Pharmacophore-based small molecule CXCR4 ligands. (2012)
  • 著者名/発表者名: Narumi T, Tanaka T, Hashimoto C, Nomura W, Aikawa H, Sohma A, Itotani K, Kawamata M, Murakami T, Yamamoto N, Tamamura H.
  • 雑誌名: Bioorg. Med. Chem. Lett. 巻: 22 ページ: 4169-4172
  • DOI: DOI:10.1016/j.bmcl.2012.04.032
• [雑誌論文] Evaluation of a synthetic C34 trimer ofHIV-1 gp41 as AIDS vaccines. (2012)
  • 著者名/発表者名: Hashimoto C, Nomura W, Ohya A, Urano E, Miyauchi K, Narumi T, Aikawa H, Komano JA, Yamamoto N, Tamamura H
  • 雑誌名: Bioorg. Med. Chem. 巻: 20 ページ: 3287-3291
  • DOI: DOI:10.1016/j.bmc.2012.03.050
• [学会発表] ジンクフィンガー融合型酵素による遺伝子発現制御法の開発 (2013)
  • 著者名/発表者名: 野村 渉
  • 学会等名: 日本薬学会第133年会
  • 発表場所: 横浜市
  • 年月日: 20130327-20130330
  • 招待講演
• [学会発表] Development of Zinc Finger Enzymes for Genome Engineering. (2012)
  • 著者名/発表者名: Nomura W, Masuda A, Tamamura H
  • 学会等名: The First International Symposium on Biofunctional Chemistry
  • 発表場所: Tokyo, Japan
  • 年月日: 20121128-20121130
• [学会発表] 人工酵素のデザインに基づくゲノム修飾・編集法の開発 (2012)
  • 著者名/発表者名: 野村 渉
  • 学会等名: 「細胞を創る」研究会5.0
  • 発表場所: 横浜市
  • 年月日: 20121121-20121122
  • 招待講演
• [学会発表] 設計型DNA組換え酵素の配列特異的反応に関する定量的解析 (2012)
  • 著者名/発表者名: 増田朱美、野村渉、玉村啓和
  • 学会等名: 第49回ペプチド討論会
  • 発表場所: 鹿児島市
  • 年月日: 20121107-09
• [学会発表] Development of zinc finger nucleases targeting Epstain-Barr virus genome for suppression of viral production in B cells. (2012)
  • 著者名/発表者名: Nomura W, Kondo A, Masuda A, Ryo A, Tamamura H
  • 学会等名: FASEB SRC, Genome Engineering: Research & Applications
  • 発表場所: Lucca, Italy
  • 年月日: 20120902-20120907
• [学会発表] Studies of Designer Zinc Finger Enzymes and Applications for Genome Editing and Modification. (2012)
  • 著者名/発表者名: Nomura W, Masuda A, Kondo A, Ohba K, Yamamoto N, Tamamura H
  • 学会等名: The 26th Annual Symposium of the Protein Society
  • 発表場所: San Diego, USA
  • 年月日: 20120805-20120808
• [学会発表] ジンクフィンガー融合型酵素によるゲノム編集法の開発 (2012)
  • 著者名/発表者名: 野村 渉、増田朱美、卜部亜里沙、玉村啓和
  • 学会等名: 日本ケミカルバイオロジー学会 第7回年会
  • 発表場所: 京都市
  • 年月日: 20120607-20120609
• [図書] 「HIV阻害剤・腫瘍認識プローブとしてのケモカイン受容体リガンド」ペプチド医薬の最前線 (2012)
  • 著者名/発表者名: 野村 渉、田中智博、玉村啓和
  • 総ページ数: 240
  • 出版者: （株）シーエムシー出版
• [備考] 東京医科歯科大学生体材料工学研究所メディシナルケミストリー分野ウェブページ
  • URL: http://www.tmd.ac.jp/i-mde/www/molb/member/nomura.html