| 研究概要 |
本研究の目的は，「非内在性マイクロRNA（miRNA）を創製し，それを用いて遺伝子の発現を制御する」ことである。この目的を達成するために，平成25年度は以下の5つの項目に分けて研究を進めた。
1. 人工pre-miRNAライブラリーの作製: 前年度までに，ホタルルシフェラーゼ遺伝子の3’-非翻訳領域（3'-UTR）にmiR122の標的配列を含むレポーターベクターの作製，および，成熟miR122鎖のアンチセンス側を部分的にランダム化したpre-miR122 dopedライブラリーを含む発現ベクターの調製を行った。 2. レポーター遺伝子，および人工pre-miRNAライブラリーを発現する細胞株の作製：前年度までに単離したピューロマイシン耐性耐性株を用いて，cell-basedセレクションの条件検討を行ったところ，最適な条件を見い出すに至らなかった。そこで，新たにピューロマイシン耐性株を単離し，各細胞株のピューロマイシン耐性遺伝子の発現をリアルタイムPCRにより定量し，耐性と発現量の相関を調べた。3. 低分子化合物と人工pre-miRNAとの相互作用をレポーター遺伝子の活性により評価，選別： 2で作製したピューロマイシン耐性株を用いて，化合物に結合する人工pre-miR122の配列を選別する。 4. 化合物に結合する人工pre-miRNA配列をプール化，発現ベクターへの再組み込み：3で得られた配列をプール化し，発現ベクターへ組み込んだのち，HEK293細胞へトランスフェクションする。より厳しい条件（ピューロマイシンの濃度を上げるなど）でセレクションを行う。 5. 得られた人工pre-miRNA配列と化合物による，標的遺伝子の発現制御：3, 4により得られた配列を用い，化合物によって人工pre-miR122のプロセシングが制御できるか，それにより標的遺伝子の発現を調節できるかどうかを検討する。
|
