| 研究課題/領域番号 |
23750182
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
吉村 英哲 東京大学, 理学(系)研究科(研究院), 特任助教 (90464205)
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| 研究期間 (年度) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| キーワード | 蛋白質 / 細胞・組織 / 生体分子 / 1分子計測（SMD） |
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| 研究概要 |
本研究は、細胞表面に存在する受容体の集合状態を光照射により人為的に制御することで、細胞に時空間的にバイアスのかかったシグナルを与え、細胞の生理機能をコントロールする手法の開発を目指している。H23年度は、この手法の開発に当たっての心臓部とも言える、光感応性蛋白質の単離精製法の開発を行った。具体的には、植物由来の光感応性タンパク質CRY2と、活性化されたCRY2と二量体を形成するタンパク質CIB1の遺伝子を入手した。続いてCIB1の遺伝子を大腸菌用発現ベクターに組み込んだ。このベクターを用いて大腸菌を形質転換し、低温で長時間培養することでリコンビナントのCIB1を得た。また、PCR法により、CIB1の機能ドメインのみから成るCIBNの遺伝子を作製した。これも大腸菌用発現ベクターに組み込み、形質転換した大腸菌を用いてリコンビナントCIBNを得た。CIB1、CIBNともに、ニッケルキレートアフィニティーカラムを用いた精製により単離することに成功した。一方、CRY2は、ターゲットとなる細胞表面の受容体分子CD59との融合タンパク質を形成させた。既に保有しているCD59のほ乳類細胞用発現ベクターにCRY2遺伝子を組み込み、CRY2-CD59融合タンパク質のほ乳類用発現ベクターを構築した。これをヒト由来細胞株であるHeLa細胞にトランスフェクションし、細胞内で発現させた。この細胞を1分子蛍光観察が可能な全反射蛍光顕微鏡を用いて観察すると、CRY2-CD59融合タンパク質が細胞膜上を自由拡散している様子が観察された。以上のことから、構築したCRY2-CD59融合タンパク質は、培養細胞上で適切に発言することに成功したと言える。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
H23年度は、本研究の目的である細胞内受容体の光制御を行うに当たって必要なツールを構築することに成功した。特に、1年間でCIB1およびCIBNタンパク質の大量発現系の構築、単離精製法の確立を行ったことは評価するに値する。通常、タンパク質の機能解析を行うための発現系構築と単離精製には非常に長期間の時間がかかることが多く、場合によっては数年の単位で時間がかかる。本研究では、既にCIBの単離精製まで成功し、非常に順調に研究が進展していると言える。また同時に、ターゲットとなる受容体分子側も、光感応性蛋白質との融合タンパク質を構築することに成功し、全反射蛍光顕微鏡を用いてその1分子動態解析まで成功している。以上のことから、本研究は現在順調に進展していると評価できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
H24年度は、H23年度に構築したCIBをナノ粒子表面に修飾することで、光感応性分子修飾ナノ粒子を構築する。修飾の方法としては、ナノ粒子表面にストレプトアビジンを修飾したものを用意し、そこにビオチン化タグ抗体を結合する。一方CIB側にはその抗体に認識されるエピトープタグを付加しておく。抗体-ナノ粒子コンジュゲートとCIBを反応させることで、CIB修飾ナノ粒子を構築する。ただし、CIBをナノ粒子表面に集積させることで、本来の機能が失われる可能性がある。そこで新たな手法として、球状タンパク質フェリチンとCIBのコンジュゲートを作製し、直径約20nmのCIB修飾球状タンパク質を構築する。これらをCRY2-CD59を発現させた細胞に作用させることで、細胞内にカルシウム放出などの生理機能を作動させることを目指す。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
本研究は、継続的な遺伝子組み換え実験および細胞培養実験を必要とする。また、顕微鏡下で観察するため、顕微鏡の性能を維持するために光学部品を定期的に補充する必要がある。次年度の研究費の大部分は、これら消耗品費として使用する。残りについてはH24年度に得られた成果を発表するための学会に参加するための旅費として使用する。
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