| 研究課題/領域番号 |
23770107
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
伊藤 桜子 東京大学, 放射光連携研究機構, 特任助教 (60597152)
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| 研究期間 (年度) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| キーワード | X線結晶解析 / 小胞輸送 |
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| 研究概要 |
真核生物の細胞内では、積み荷を積んだ多数の小胞が、それぞれの標的膜を目指して移動している。どのようにしてそれぞれの小胞は、目的とする標的膜を正確に見つけて融合するのだろうか？Rabファミリータンパク質は、小胞・標的膜表面に存在して膜の属性を示す役割を持つ。SNAREタンパク質は標的膜との融合を行う因子であり、こちらも小胞や膜の種類に依存して複数の相補的な組み合わせがある。本研究では、Rabを膜表面に埋め込む活性を持つ膜タンパク質Pra1とSNAREタンパク質VAMP2が相互作用するという報告に着目して、Pra1-VAMP2複合体の立体構造解析により、小胞と標的膜の効率的な融合機構を解明することを目的としている。平成23年度は、立体構造解析により適したPra1サンプルを調製することに主眼を置いて研究を行った。Pra1は、低分子輸送体ではなく情報伝達分子である膜タンパク質であるという点においても、構造解析のターゲットとしての重要性を持つ。研究開始時に既に、安定なPra1サンプルの調製方法を確立していたが、このサンプルからはX線結晶構造解析に適した質の結晶を得ることができなかった。そこで、Pra1のアミノ酸配列の改変（切り詰めや変異体作製、結晶化しやすいタンパク質との融合タンパク質化）や界面活性剤の検討などにより、Pra1サンプル調製法の最適化を行った。更に、Pra1に対するモノクローナル抗体を作製し、これを用いて結晶化に適したPra1・抗体複合体の調製も行っている。並行して、Pra1とVAMP2の昆虫細胞における共発現系を作製した。この共発現系では、Pra1の発現は見られたものの、VAMP2の発現を確認することはできなかったので、今後、別の方法を用いてPra1・VAMP2複合体の調製を試みる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Pra1・VAMP2複合体の立体構造解析に向けて、X線結晶構造解析に適したPra1サンプルの調製方法の最適化が順調に進行した。また、VAMP2の調製方法の検討も進行した。
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| 今後の研究の推進方策 |
X線結晶構造解析に適したPra1サンプルを用いて、解析可能な質を持つ結晶を作製し、大型放射光施設におけるX線回折実験を経て、Pra1の立体構造を決定する。同時に、昆虫細胞における共発現系以外の方法を用いて、Pra1・VAMP2複合体の調製を行う。具体的には、大腸菌で発現させたVAMP2の精製、Pra1との複合体化、VAMP2のドメイン化などを行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
実験に必要な消耗品（一般試薬、合成DNA、培地、精製用カラムなど）の他、大型放射光施設への出張費や、学会発表のための出張費に用いる。また、研究成果をまとめた論文の掲載料にも用いる。
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