| 研究課題/領域番号 |
23770117
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
三間 穣治 大阪大学, たんぱく質研究所, 特任准教授 (30335301)
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| 研究期間 (年度) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| キーワード | 蛋白質 / 脂質 |
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| 研究概要 |
細胞内オルガネラ膜融合は、複雑な細胞内膜系を持つ真核細胞において、必須かつ根源的な生体反応であり、エンドサイトーシス、シナプス神経伝達、オートファジーなどの重要な生命現象にも深く関わっている。しかしながら、従来の主力である遺伝学・細胞生物学・生化学的手法だけでは、多様な膜タンパク質群と脂質群が織りなす、この「オルガネラ膜融合マシナリー」を分子レベルで解き明かすことは、非常に困難であるのが現状であった。 そこで、我々は、全て精製した膜タンパク質群と人工脂質二重膜リポソームから構築する、化学的に純粋な実験系である「試験管内"完全"再構成系」を手法の中心に据える。そして、出芽酵母エンドソーム・リソソーム系をモデルに、「時空間的に厳密に制御されたオルガネラ膜融合」を分子レベルで捉え、その動作原理の更なる理解を目指す。 平成23年度では、酵母液胞をモデルの中心とし、「オルガネラ膜融合の試験管内"完全"再構成系」を実験材料・手法の基盤とし研究を行った。主要な研究プロジェクトとしては、オルガネラ膜融合の細胞内コンパートメント特異性に対するSNAREタンパク質の寄与について、タンパク質-タンパク質間相互作用解析および再構成プロテオリポソーム膜融合アッセイを駆使して、多くの新しい知見が得られた。その中でも、R-SNAREサブファミリーではなく、Qabc-SNARE複合体の適切な組合せがオルガネラ膜融合の特異性決定に重要であることを新たに見出し、この成果は原著論文として発表した（Izawa, Onoue, Furukawa, & Mima, 2012, J. Biol. Chem）。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の予定どおり、酵母エンドソーム・リソソーム（液胞）系のSNAREタンパク質について、大量発現系の構築および効率的な精製方法の確立が完了した。さらに、SNAREシャペロンやテザリング複合体など、他のリコンビナントタンパク質精製の実験系もおおむね順調に進展している。また、本研究課題で精製を完了したSNAREタンパク質を用いた機能解析（蛋白質間相互作用解析、再構成リポソーム膜融合アッセイなど）についても、順調に進捗し、その成果は原著論文として発表することが出来た（Izawa, Onoue, Furukawa, & Mima, 2012, J. Biol. Chem）。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成23年度は既出のとおり、リコンビナントタンパク質の精製、再構成プロテオリポソームの調製、などの実験材料、そして蛋白質間相互作用解析や膜融合アッセイを始めとする機能解析、これら両面で順調に進捗した。今後は、SNAREシャペロン群およびテザリング複合体を中心に、オルガネラ膜融合に関与する因子の精製タンパク質の更なる充実を目指す。また、機能解析においても、蛋白質-脂質間結合アッセイや再構成リポソーム凝集アッセイなど、新規アッセイ法の確立を精力的に進める予定である。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
平成23年度から継続して、これまで大量調製したタンパク質因子群・再構成プロテオリポソーム群を試料とし、プロテオリポソーム膜融合アッセイを中心とする機能解析によって、SNAREタンパク質依存性膜融合を網羅的に解析する。さらに、新規に大量精製系が確立次第、他の膜融合因子（SNAREシャペロン群、テザリング複合体など）についても、再構成プロテオリポソーム系でそれらの分子機能を探索する。 また、リポソーム膜融合アッセイに加えて、平成24年度には、SPR（表面プラズモン共鳴）、蛍光偏光解消、FRETによる、脂質膜上での「タンパク質―タンパク質間・タンパク質―脂質間・脂質―脂質間相互作用のリアルタイムアッセイ法」の確立に着手する。その後、膜融合アッセイで得られた機能解析の成果と、個々の分子間相互作用との相関を分析する。
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