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"unloading(負荷軽減）”による筋萎縮の原因蛋白質であるCbl-bは、ユビキチン-プロテアソーム依存性の蛋白質分解経路において、ユビキチンを基質に付加する反応を触媒するユビキチンリガーゼ（E3)として働き、筋芽細胞の重要な増殖シグナル分子IRS-1の分解を促進する。本研究では、Cbl-bのE3活性に必須であるY363のリン酸化に着目し、リン酸化によるCbl-bのユビキチンリガーゼ活性の調節機構の構造的基盤を解明することを研究の目的として行った。前年度までに、リン酸化状態を模倣したCbl-b Y363E(39-465)変異体の大量調製系の確立・結晶化条件の探索を行ったが、年度末に、海外のグループから、c-Cblのリン酸化状態の結晶構造が報告され、リン酸化に伴う構造変化及び活性発現機構が明らかにされた。c-CblとCbl-bのアミノ酸配列上の相同性から、Cbl-bにおいても同様の現象が起こっていることが予想された。そこで、当初の研究計画を変更し、今年度は、Cbl-bと基質であるリン酸化状態のIRS-1との結合に着目し、基質認識機構を明らかにすることを試みた。はじめに、IRS-1のリン酸化サイトを模倣したとCbl-bの基質認識ドメインであるTKBドメインとの複合体結晶構造決定を行った。その結果、このペプチドがリン酸化チロシンを中心に、TKBドメインの塩基性アミノ酸に富むポケットと結合していることがわかった。また、既に報告されているTKBドメインとリン酸化チロシン含有ペプチドの複合体構造と比較した結果、このペプチドとCbl-b TKBドメインの間のみ見られる特異的な相互作用を見出した。
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