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2012 年度 実施状況報告書

チトクロム酸化酵素反応機構全容の解明を目指す反応中間体の吸収スペクトルの決定

研究課題

研究課題/領域番号 23770152
研究機関兵庫県立大学

研究代表者

柳澤 幸子  兵庫県立大学, 生命理学研究科, 助教 (60557982)

キーワード生体エネルギー変換 / 振動分光 / 酸素活性化 / 金属タンパク質 / 吸収スペクトル
研究概要

本研究では、呼吸鎖電子伝達系末端において酸素分子を水にまで還元する反応と共役して、プロトンを膜の内側から外側へと能動輸送するチトクロム酸化酵素(CcO)の酸素還元反応とプロトン輸送反応、およびそれらの共役の仕組みの解明を目指す。酸素還元反応のいくつかの反応中間体が振動分光法により既に明らかにされているが、本研究では、それらについて吸収スペクトルを決定する。理由として、吸収スペクトルの測定は他の手法と組み合わせる事が容易であり、共役機構解明の上で必要不可欠な動的構造解析を種々の手法を用いて行なう時に、酸素還元反応のどの段階を検出しているのかを知る基準となるからである。本研究では酵素反応追跡用人工心肺装置を用い、時間分解共鳴ラマン分光法によりウシ心筋由来 CcOの酸素還元反応を追跡する。この装置を使うと比較的少ない試料で測定が可能であり、限られた量の試料を用いて質の高いスペクトルが得られる。実験は、ラマン検出用レーザー光と同軸に吸収スペクトル測定用白色光を重ね、酸素還元反応の開始後同時刻においてラマンスペクトルと吸収スペクトルを測定し、それぞれの吸収スペクトルが酸素還元反応のどの段階のものであるのかを明らかにし、それによって反応中間体の吸収スペクトルを決定するというものである。昨年度において人工心肺装置の改良と測定条件の検討により必要とする酵素試料を減らし、ラマン及び吸収スペクトルの同時測定のための光学系をほぼ確立したが、今年度においては吸収スペクトルを測りうる波長領域の拡大と白色光源の光量を上げることを課題とした。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

本年度においては昨年度ほぼ完成したラマンおよび吸収スペクトルを同時に測定するための光学系の改良を行った。これは、サンプル点における光量をより多くすることが目的であった。その点において目的は達成された。しかし、これまでに報告されているCcOの反応中間体の寿命と異なるデータが得られたため、その原因の究明が必要となった。また、レーザーシステムが期せずして不安定化しその調整に時間を要したため、ラマンスペクトルの測定が出来ていない。このため、ラマンスペクトルと吸収スペクトルの同時測定を行い、本年度において反応中間体の吸収スペクトルを決定する当初の目標は達せられていない。少し遅れたが25年度中に達成する見通しである。一方で、反応中間体の寿命が異なる点について調べる上で緩衝液の水素イオン濃度を変更する実験を試みたところ、これまで一本と考えられていた鉄-ヒスチジン伸縮振動に由来するラマンバンドを二本検出した。このことは、CcOの酸素還元反応とプロトンポンプンプ共役機構を理解する上で意義深い。この点については、想定外の進展であった。

今後の研究の推進方策

研究室の移転が年度末に行われ、システムが部品にまで分解・梱包されており、これらを再度組み立てる。これを一刻も早くに行い、システムに最適な条件を確立する。確立後はラマンスペクトルと吸収スペクトルの同時測定を繰り返し行い、各中間体の吸収スペクトルの決定を目指す。

次年度の研究費の使用計画

システムの再組み立ておよび最適化に必要な部品の購入。成果発表や学術調査のための旅費。

  • 研究成果

    (9件)

すべて 2013 2012

すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 4件) 学会発表 (5件) (うち招待講演 2件)

  • [雑誌論文] Resonance Raman Study on Indoleamine 2,3-Dioxygenase: Control of Reactivity by Substrate-Binding2013

    • 著者名/発表者名
      Sachiko Yanagisawa, Masayuki Hara, Hiroshi Sugimoto, Yoshitsugu Shiro and Takashi Ogura
    • 雑誌名

      Chem. Phys.

      巻: in press ページ: in press

    • DOI

      10.1016/j.chemphys.2013.02.032

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Interaction of dimeric horse cytochrome c with cyanide ion2013

    • 著者名/発表者名
      Ari Dwi Nugraheni, Satoshi Nagao, Sachiko Yanagisawa, Takashi Ogura and Shun Hirota
    • 雑誌名

      J Biol Inorg Chem

      巻: 18 ページ: 383-390

    • DOI

      10.1007/s00775-013-0982-8

    • 査読あり
  • [雑誌論文] The influence of active site loop mutations on the thermal stability of azurin from Pseudomonas aeruginosa2012

    • 著者名/発表者名
      Rita Guzzi,Luigi Sportelli,Sachiko Yanagisawa,Chan Li,Dorota Kostrz,Christopher Dennison
    • 雑誌名

      Archives of Biochemistry and Biophysics

      巻: 521 ページ: 18-23

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Synthesis, Characterization, and Reactivity of Hypochlorito-Iron(III) Porphyrin Complexes2012

    • 著者名/発表者名
      Zhiqi Cong, Sachiko Yanagisawa, Takuya Kurahashi, Takashi Ogura, Satoru Nakashima and Hiroshi Fujii
    • 雑誌名

      J. Am. Chem. Soc.

      巻: 134 ページ: 20617-20620

    • DOI

      10.1021/ja3108774

    • 査読あり
  • [学会発表] インドールアミン2,3ジオキシゲナーゼの共鳴ラマンスペクトル: 基質結合による反応性の調節2013

    • 著者名/発表者名
      柳澤幸子・原 雅行・杉本 宏・城 宜嗣・小倉尚志
    • 学会等名
      日本化学会第93春季年会
    • 発表場所
      立命館大学 くさつ・びわこキャンパス(滋賀県)
    • 年月日
      20130322-20130325
  • [学会発表] ヘムをヘム垂線のまわりに90°回転した時の共鳴ラマンスペクトル変化:ヘムオキシゲネース2012

    • 著者名/発表者名
      Sachiko Yanagisawa, Hiroshi Fujii, Saburo Neya, Takashi Ogura and Teizo Kitagawa
    • 学会等名
      第50回生物物理学会年会
    • 発表場所
      名古屋大学東山キャンパス(愛知県)
    • 年月日
      20120922-20120924
  • [学会発表] Effects of Heme Rotation around the Heme Normal by 90 ° on Resonance Raman Spectra of Heme Proteins; Observation for Heme Oxygenase2012

    • 著者名/発表者名
      Sachiko Yanagisawa, Hiroshi Fujii, Saburo Neya, Takashi Ogura, and Teizo Kitagawa
    • 学会等名
      ICORS 2012
    • 発表場所
      バンガロール(インド)
    • 年月日
      20120812-20120817
    • 招待講演
  • [学会発表] Dioxygenation reaction of indoleamine 2,3-dioxygenase as studied by resonance Raman spectroscopy2012

    • 著者名/発表者名
      Sachiko Yanagisawa, Masayuki Hara, Hiroshi Sugimoto, Yoshitsugu Shiro and Takashi Ogura
    • 学会等名
      ICPP-7
    • 発表場所
      チェジュ島(韓国)
    • 年月日
      20120701-20120706
    • 招待講演
  • [学会発表] 共鳴ラマン分光法によるインドールアミン2,3ジオキシゲナーゼの反応機構の研究2012

    • 著者名/発表者名
      柳澤 幸子、原 雅行、杉本 宏、城 宜嗣、小倉 尚志
    • 学会等名
      第39回生体分子科学討論会
    • 発表場所
      東北大学(宮城県)
    • 年月日
      20120608-20120609

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公開日: 2014-07-24  

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