溶媒クエンチ法と蛋白質工学の融合による巨大蛋白質複合体の構造揺らぎ解析

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 23770194
• 研究機関: 山形大学
• 研究代表者: 真壁 幸樹 山形大学, 理工学研究科, 准教授 (20508072)
• キーワード: GroEL / 水素交換 / 蛋白質

研究概要

蛋白質分子は本質的には動的であり、その機能を理解するには構造揺らぎを正しく評価する必要がある。しかしながら、これまでは測定方法の限界から、比較的小さな蛋白質のみがNMR法を用いた構造揺らぎ測定の対象となっていた。本研究では溶媒クエンチ水素・重水素交換NMR法と蛋白質工学的手法とを組み合わせることによって、巨大蛋白質分子複合体GroEL/ESの構造揺らぎの解明を目指す。これにより従来の静的な蛋白質の構造・機能相関の見方を超えて、これまで未踏であった巨大蛋白質複合体がどのような構造揺らぎを持ち、機能を発現しているのか明らかにする。平成２４年度までに溶媒クエンチ法によるGroESの水素・重水素交換反応を明らかにし、さらにGroELの頂上ドメインを単独で大腸菌発現し、水素・重水素交換反応を行った。
昨年度に行った頂上ドメイン単独での水素／重水素交換反応に引き続き、本年度は頂上ドメインをインテインと融合させた蛋白質分子の構築を行った。インテインとしてMxe GyrAが融合されるpTXB1システムを用いた。NdeI及びXhoIサイトを用いて頂上ドメインをサブクローニングしてインテインのN末端側に融合させた。大腸菌BL21(DE3)株による組み替え体の発現に成功した。これによって頂上ドメインのC末端をチオエステル化した誘導体が作製でき、今後、GroELの他の領域とタンパク質ライゲーションを行う基盤を確立できた。

研究成果

• [雑誌論文] Dissection of the ATP-dependent conformational change cycle of a group II chaperonin. (2014)
  • 著者名/発表者名: Nakagawa A, Moriya K, Arita M, Yamamoto Y, Kitamura K, Ishiguro N, Kanzaki T, Oka T, Makabe K, Kuwajima K, Yohda M.
  • 雑誌名: J Mol Biol. 巻: 426 ページ: 447-459
  • DOI: 10.1016/j.jmb.2013.09.034.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural insights into the stability perturbations induced by N-terminal variation in human and goat α-lactalbumin. (2013)
  • 著者名/発表者名: Makabe K, Nakamura T, Kuwajima K
  • 雑誌名: Protein Eng Des Sel. 巻: 26 ページ: 165-170
  • DOI: 10.1093/protein/gzs093.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Molecular mechanisms of the cytotoxicity of human α-lactalbumin made lethal to tumor cells (HAMLET) and other protein-oleic acid complexes. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nakamura T, Aizawa T, Kariya R, Okada S, Demura M, Kawano K, Makabe K, Kuwajima K.
  • 雑誌名: J Biol Chem. 巻: 288 ページ: 14408-14416
  • DOI: 10.1074/jbc.M112.437889.
  • 査読あり
• [雑誌論文] The H/D-exchange Kinetics of the Escherichia coli Co-chaperonin GroES Studied by 2D-NMR and DMSO-Quenched Exchange Methods. (2013)
  • 著者名/発表者名: Chandak MS, Nakamura T, Makabe K, Takenaka T, Mukaiyama A, Chaudhuri TK, Kato K, Kuwajima K.
  • 雑誌名: J Mol Biol. 巻: 425 ページ: 2541-2560
  • DOI: 10.1016/j.jmb.2013.04.008.
  • 査読あり
• [雑誌論文] NMR characterization of the interaction of GroEL with amyloid β as a model ligand. (2013)
  • 著者名/発表者名: Yagi-Utsumi M, Kunihara T, Nakamura T, Uekusa Y, Makabe K, Kuwajima K, Kato K.
  • 雑誌名: FEBS Lett. 巻: 587 ページ: 2541-2560
  • DOI: 10.1016/j.febslet.2013.04.007.
  • 査読あり
• [雑誌論文] ATP dependent rotational motion of group II chaperonin observed by X-ray single molecule tracking. (2013)
  • 著者名/発表者名: Sekiguchi H, Nakagawa A, Moriya K, Makabe K, Ichiyanagi K, Nozawa S, Sato T, Adachi S, Kuwajima K, Yohda M, Sasaki YC.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 8 ページ: e64176
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0064176.
  • 査読あり
• [雑誌論文] The catalytic domain of topological knot tRNA methyltransferase (TrmH) discriminates between substrate tRNA and non-substrate tRNA via an induced-fit process. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ochi A, Makabe K, Yamagami R, Hirata A, Sakaguchi R, Hou YM, Watanabe K, Nureki O, Kuwajima K, Hori H.
  • 雑誌名: J Biol Chem. 巻: 288 ページ: 25562-25574
  • DOI: 10.1074/jbc.M113.485128.
  • 査読あり