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申請者はリンドウに導入したCaMV-35Sプロモーター配列のエンハンサー領域が、配列特異的なDNAメチル化による発現抑制を引き起こすことを見出している。しかしながら、このような現象がリンドウ以外の植物種で起こる可能性については検証されていない。一方レタスでは35Sプロモーターを含む外来遺伝子の発現抑制が報告されており、リンドウと類似の現象である可能性がある。そこで本研究では、35Sプロモーターを含む外来遺伝子をレタスに導入し、組換えレタスにおいてもリンドウと同様の発現抑制現象が生じるかを検討した。
アグロバクテリウム法により、野生型、及び35Sエンハンサー領域に変異を導入した35Sプロモーター、もしくはリンドウの研究でメチル化の誘導に関与していることが推定された35Sエンハンサー由来の64塩基の配列を、GFP遺伝子を連結した外来遺伝子をレタスに導入した。得られた組換え植物のゲノムDNAを抽出し、サザン解析を行った結果、1～11コピーのT-DNAの挿入が確認された。これら組換え体の葉組織よりRNAを抽出し、ノザン解析により導入遺伝子のmRNA発現を調査した結果、野生型35Sプロモーターを導入した系統ではGFP遺伝子の発現が抑制されていたが、エンハンサー領域に変異を導入した系統では、発現している系統が認められた。
得られた組換え体のうちシングルコピーを含む数系統について、バイサルファイトシークエンス法により35Sプロモーターのエンハンサー領域におけるDNAメチル化を解析した。野生型35Sプロモーターを導入した系統では、組換えリンドウと同様に、解析した領域において高度なDNAメチル化が確認された。一方、35Sエンハンサー領域に変異を導入した系統ではDNAメチル化がみられない系統が見出されたことから、エンハンサー領域の変異がDNAメチル化に影響を与えた可能性が示唆された。
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