研究課題
本研究では、菌根機能を評価する有効な指標を見出すため、リン酸輸送に関わる植物と菌根菌の遺伝子・タンパク質・生体分子を解析し、菌根のリン酸輸送の分子メカニズムを明らかにすることを目的とした。課題１では、菌根菌のポリリン酸分解酵素と合成酵素の遺伝子を同定し機能解析することで、菌糸内でのポリリン酸代謝を明らかにすることを目的とした。アーバスキュラー菌根菌Glomus intraradicesのポリリン酸合成酵素GiVTC4を大腸菌で発現させ、精製後にATPを基質としてポリリン酸合成活性を測定した。GiVTC4は大腸菌のPPKに比べて活性は低いものの、ポリリン酸を合成することが明らかとなった。次にGiVTC4の抗体を用いて免疫電顕を行ったが、十分なシグナルを得ることはできなかった。今後、抗体の種類や賦活化などを検討する予定である。課題２では、ミヤコグサの菌根特異的酸性ホスファターゼLjPAP3のノックダウン系統を作製し、菌根菌のポリリン酸局在や代謝に及ぼすLjPAP3の影響を明らかにすることを目的とした。LjPAP3のRNAi系統を用いて菌根菌のポリリン酸局在を解析した。検出感度を向上させるために、従来から用いられてきたSpurr樹脂に代わって親水性のLR White樹脂を用いた。LR White樹脂を用いることでラベルの量は上昇したが、非特異的なシグナルが上昇しておりポリリン酸検出にLR Whiteを使用するのは難しいと思われた。次に、LjPAP3を酵母Pichia pastorisで発現させることを試みたが、未だ十分な量のタンパク質を精製するには至っていない。LjPAP3の抗体を用いて免疫電顕を行い、LjPAP3は植物と菌との境界であるペリアーバスキュラースペースに分泌されることが明らかとなった。
3: やや遅れている
［課題１］菌根菌のポリリン酸分解・合成酵素の同定と機能解析当初の予定通り、ポリリン酸合成酵素GiVTC4の活性を検出することができたが、GiVTC4の局在を免疫電顕で明らかにすることはできなかった。この原因として、抗体の種類や免疫電顕で行う賦活化処理にあると思われる。［課題２］ミヤコグサ酸性ホスファターゼのポリリン酸代謝LjPAP3の局在解析は予定通りに実施し、LjPAP3がペリアーバスキュラースペースにあることを明らかにできた。一方で、酵母Pichia pastorisタンパク質発現系でのLjPAP3精製については、未だ十分な量のタンパク質が得られず、生化学的な特性の解析には至っていない。また、RNAi系統を用いたポリリン酸局在についても、LR White樹脂を用いた検出法が困難であることが明らかとなり、現在手法の再検討を行っている段階である。
［課題１］菌根菌のポリリン酸分解の同定と機能解析昨年度に引き続き、ポリリン酸合成酵素GiVTC 4の局在を明らかにする。今年度は抗体の種類を検討するとともに、いくつかの賦活化条件を検討し、外生菌糸と内生菌糸におけるポリリン酸合成酵素の局在を明らかにする。［課題２］ミヤコグサ酸性ホスファターゼのポリリン酸代謝昨年度に引き続きミヤコグサLjPAP3のRNAiノックダウン系統を用いて、ポリリン酸ラベリング法を用いて菌根のポリリン酸局在を詳細に解析する。今年度はポリリン酸の検出にSpurr樹脂に包埋した試料を用いてエッチング法を再検討し、ポリリン酸の検出感度を高める。また、LjPAP3の酵素活性については、Pichia pastorisの複数の株を検討し、高発現のクローンを選抜し、大量のLjPAP3精製を目指す。精製後はポリリン酸分解活性等の生化学特性を評価する。
該当なし
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