| 研究課題/領域番号 |
23780120
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| 研究機関 | 富山県立大学 |
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研究代表者 |
野村 泰治 富山県立大学, 工学部, 助教 (40570924)
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| 研究期間 (年度) |
2011-04-28 – 2014-03-31
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| キーワード | チューリップ / チューリッポシド / チューリッパリン / チューリッポシド変換酵素 / カルボキシルエステラーゼ / 二次代謝 |
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| 研究概要 |
チューリップにおける主要二次代謝産物である「チューリッポシド(Pos)類」は、チューリップ組織内のチューリッポシド変換酵素（tuliposide-converting enzyme; TCE）によってアグリコンのラクトン化体である「チューリッパリン(Pa)類」へと変換される。Pa類は抗菌、殺虫等の活性を示すことから、PosからPaへの変換反応はチューリップの生体防御において重要な役割を担っていると考えられる。Pos/Pa変換系の全容を分子レベルで明らかにするため、今年度はPosA変換酵素（TgTCEA)遺伝子の単離・機能解析を行った。 精製酵素の部分アミノ酸配列に基づいたdegenerate-PCRおよびRACE-PCRを行うことで、チューリップ花弁からTgTCEA1およびTgTCEA2の2種の新規遺伝子cDNAを単離した。大腸菌発現組換え酵素を用いた機能解析によって、両遺伝子がPosA変換酵素をコードしていることを明らかにした。また、定量RT-PCRによる転写レベル解析によって、TgTCEA1, TgTCEA2両遺伝子は球根以外の全組織において構成的に転写されていることを示した。さらに、GFP融合タンパク質を用いた細胞内局在解析によって、TgTCEA酵素が細胞内ではプラスチドに局在することを明らかにした。 TgTCEA酵素の一次配列はカルボキシルエステラーゼと相同性を有しており、触媒残基を含む同ファミリー酵素の保存アミノ酸残基の変異によって、その活性は著しく低下した。しかしながら、TgTCEA酵素はPosAの加水分解産物であるヒドロキシ酸を経由せずに直接ラクトン化体であるPaAを生成することから、本酵素は典型的なカルボキシルエステラーゼが触媒する加水分解ではなく、分子内エステル転移反応によるラクトン形成を触媒する新規カルボキシルエステラーゼであると結論づけた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究において同定を目指している酵素遺伝子のうち、チューリッポシドA変換酵素遺伝子を単離・同定することに成功し、その酵素学的諸性質、発現様式、細胞内局在等も明らかにすることができており、研究は順調に進展していると判断できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度同定することに成功したチューリッポシドA変換酵素遺伝子に続いて、次年度はまずチューリッポシドB変換酵素遺伝子の同定を行う。チューリップ組織からの酵素精製、遺伝子単離の後、チューリッポシドA変換酵素と同様に、酵素学的諸性質、発現様式、細胞内局在を明らかにする。さらに、チューリッポシドAおよびB変換酵素のモデリングおよび変異酵素を用いた活性評価により、両酵素の基質特異性の決定に関わるアミノ酸残基の同定を試みる。これにより、チューリップにおける主要チューリッポシドであるチューリッポシドAおよびチューリッポシドBが、各々に特異的なチューリッポシド変換酵素によってチューリッパリンAおよびチューリッパリンBへとそれぞれ変換される分子機構を明らかにする。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
酵素精製用カラム担体をはじめとした生化学関連試薬、遺伝子解析に使用する分子生物学関連試薬、ならびにHPLC分析に用いるカラム等が必要であり、これらは物品費から支出する。ポリクローナル抗体作製の外注費用や論文投稿・別刷り料としてその他費用を計上している。また、旅費は国内学会参加の際に使用する。
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