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イヌのアトピー性皮膚炎の免疫病態には、ケモカインであるCCL17/TARCが重要な役割を果たしていると考えられている。応募者のこれまでの研究から、イヌケラチノサイトにおけるCCL17転写はおもにTNF-αによって誘導され、p38によって正に、ERKによって負に調節されていることが明らかとなった。このことから、p38およびERKがイヌアトピー性皮膚炎治療のための標的分子となりうることが示唆された。具体的には、p38阻害剤によってp38活性化を阻害あるいは、ERK活性化剤によってERK活性化を誘導することによって、ケラチノサイトからのCCL17産生を制御することができると考えた。本年度には、炎症性サイトカイン存在下でのケラチノサイトにおけるHB-EGF発現解析をウエスタンブロッティングによって実施した。具体的には、イヌケラチノサイトを80%コンフルエントになるまで培養し、24時間、無血清培地にて飢餓培養をおこなった。その後、CPEKの培養上清中に炎症性サイトカインであるTNF-αを添加して、経時的に細胞からタンパクを抽出した。抽出したタンパクを用いてSDS-PAGEを実施後、ヒトHB-EGF抗体を用いて、ウエスタンブロッティングをおこなった。その結果、今回実施した刺激時間では、TNF-αによる影響を受けないことが示された。本研究より、イヌケラチノサイトにおいて、TNF-αによる短期的な刺激では、HB-EGFの発現量は変化しないことが示された。今後、炎症性サイトカインによる長期的な刺激によるHB-EGF発現量の変化を検討することにより、炎症状態がHB-EGF発現に及ぼす影響を評価することができると考えられる。
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