| 研究課題/領域番号 |
23790051
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
柴田 孝之 長崎大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (10448491)
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| キーワード | ウラシル / シトシン / ベンズアミドオキシム / 蛍光反応 / 尿中ウラシル定量 / 核酸代謝 / ハイスループット診断 / 臨床検査 |
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| 研究概要 |
前年度は、3-メチルベンズアミドオキシム（3-BAO）を用いる、室温で尿中のウラシルを蛍光誘導体化できる手法を開発した。本年度は、前年度の研究成果に基づき、尿サンプルを蛍光反応に付し蛍光強度を測定するのみで尿中ウラシルを定量できる、ハイスループットな尿中ウラシル定量法の開発を試みた。
まず、尿に含まれる蛍光性の夾雑物質について詳細に検討したところ、3-BAO以外の他の反応試薬を尿に添加した場合にも、尿中蛍光物質の蛍光強度が増加することが分かった。そこで、高速液体クロマトグラフィーを用いて、試薬の種類・反応時間・反応温度を変化させて、尿中蛍光物質の反応前後における蛍光強度を網羅的に調査したところ、尿サンプルにフェリシアン化カリウムを添加せずに加熱した場合の尿中蛍光物質の蛍光強度が、全ての試薬を添加して加熱した場合のそれと等しいことを見出した。これにより、後者の総蛍光強度から前者の総蛍光強度を差し引くことにより、ウラシル由来の蛍光強度が得られることが分かった。
この結果を踏まえ、標準添加法による尿中ウラシル定量を行った。すなわち、濃度既知のウラシル標準液を尿サンプルに添加し蛍光反応に付した後、得られた蛍光強度を上述のブランクで差し引き得られた直線の切片から、尿に含まれるウラシル濃度を算出した。その結果、反応液の蛍光強度を測定するのみで尿中のウラシル濃度を定量できる手法の開発に成功した。
更に、本反応の試薬の種類、濃度、反応温度、反応時間を変化することにより、シトシン選択的な蛍光反応を発見した。この反応は、3-MBAO反応の様に、シトシン以外の核酸塩基及び全てのヌクレオシ（チ）ドに対して蛍光を与えないという、優れた特異性を示す。今後、この反応を用いた疾病診断への応用を展開する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
交付申請書に記載した平成２４年度研究計画における研究到達目標である、反応液の蛍光強度を測定するのみで尿中のウラシル濃度を定量できる手法の開発に成功しただけでなく、PCT出願及び科学技術振興機構の各国出願支援制度に採択されたこと、本蛍光反応を基にシトシン特異的蛍光反応を発見できたことを踏まえ、当初の計画以上に進展していると評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は、交付申請書に記載した研究目的に従いつつ前年度に得られた結果を踏襲し、健常人ボランティアから提供された尿サンプルを複数用いて、マイクロプレートリーダーによる尿中ウラシルのハイスループット定量法を確立する。また、本年度に発見したシトシン特異的蛍光反応を尿や血液などの生体試料に応用し、疾病診断として展開できる可能性を探索する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
次年度の研究費は主に、各種試薬の購入費に充てる。また、論文投稿に必要な諸費用と学会参加に掛かる費用を研究費から賄う予定である。
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