| 研究課題/領域番号 |
23790061
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| 研究機関 | 静岡県立大学 |
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研究代表者 |
轟木 堅一郎 静岡県立大学, 薬学部, 准教授 (70341451)
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| 研究期間 (年度) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| キーワード | 遺伝子解析 / HPLC / フルオラス化学 |
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| 研究概要 |
遺伝子発現量解析用プローブとして，オリゴDNAの両端に親フッ素性のフルオラスタグと蛍光物質フルオレセイン（FAM）を付加したFF hybridプローブを新たに開発した。本プローブとサーマルサイクラー，そしてフルオラスHPLC-蛍光検出システムを組み合せることで，既存のリアルタイムPCRと比較して感度，精度，網羅性に優れた遺伝子発現解析法を確立した。平成23年度は，（1）ハウスキーピング遺伝子解析用FF hybridプローブの合成，（2）同プローブ群を用いた各種条件（PCR反応条件，HPLC分離条件など）設定，分析バリデーションを行い，遺伝子発現量解析法としての有用性を評価した。その結果，FF hybridプローブの添加により，各遺伝子のcDNA量とPCR反応サイクル数に応じたFAM標識モノヌクレオチド（AMP，CMP，TMP）がそれぞれ遊離された。これらのHPLC-蛍光検出による分析結果をもとに，増幅サイクル数と蛍光強度の関係をプロットすることで，リアルタイムPCRと同様の増幅曲線を描けた。この増幅曲線から検量線を作成すると，各遺伝子に対し少なくとも10-100 ngの範囲で良好な定量性を示した。本法はプローブの構造を変えることでさらに多くの遺伝子量を同時定量することが可能であることから，今後，本法によるサイトカイン遺伝子群（IL，TNF-α，IFNなど）の同時発現解析などへの応用が期待できる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究計画に記載の通りに実施することができた。また当初，本研究の遂行に際し問題となりうると考えていた（1）FF hybridプローブの水系緩衝液に対する低い溶解性，（2）TaqDNAポリメラーゼの5'→3'エキソヌクレアーゼ活性が十分に機能しない，(3）1つのPCR反応液に高濃度のプローブ・PCRプライマーが存在することによるTaq PCRポリメラーゼ活性自体の阻害の可能性，なども認められなかった。次年度の実施項目であるサイトカイン関連遺伝子の解析に向けて，必要なFF hybridプローブも既に受託合成済みであり，研究の遂行に問題はないと考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
現時点ではH24年度の研究実施について，計画書記載の通りに実施することで問題なく成果が得られると考えている。しかし，申請者は分析化学を専門としているため，不足しがちな分子生物学的手技やサイトカイン解析結果の考察には所属機関や前所属機関の共同研究者に適宜指導・助言を仰ぐ。また，申請者にとって必要となる専門知識・技能の習得を目的として，日本分子生物学会，企業主催セミナーなどに積極的に参加・討論する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
受領した研究費は，申請書記載の使用計画に則って適切に使用する。研究費は主に消耗品である関連試薬（分子生物学関連，HPLC関連）の購入に充てるが，関連学会（日本薬学会，日本分析化学会，クロマトグラフィー科学会，フルオラス科学研究会，CASSS - An International Separation Science Society-等）及への成果発表用旅費や，投稿論文の英文校閲料等にも使用する。
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