• 研究課題をさがす
  • 研究者をさがす
  • KAKENの使い方
  1. 課題ページに戻る

2012 年度 実施状況報告書

脳関門P糖タンパクの単分子輸送活性と発現量に基づく薬物脳移行性の病態変動の解明

研究課題

研究課題/領域番号 23790170
研究機関東北大学

研究代表者

内田 康雄  東北大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (70583590)

キーワード病態血液脳関門 / P糖タンパク / 単分子輸送活性 / 絶対発現量 / In vivo機能の再構築 / Caveolin1 / 炎症 / Pharmacoproteomics
研究概要

H24年度は、炎症時の血液脳関門のP糖タンパク(P-gp)の絶対発現量を解明し、H23年度に解明済みの正常時のP-gpの単分子輸送活性を統合することによって、炎症時のin vivo血液脳関門のP-gp排出輸送活性及び脳への薬物移行量を再構築できるか否かを解明する事を目的とした。再構築できない場合は、P-gp単分子活性の病態変動機構を解明し、それに基づく新たな再構築法が必要である。その準備段階として、P-gp活性に影響を与えうるcaveolin1のリン酸化の定量系を構築する事を目的とした。
3 mg/kg LPS投与により炎症モデルマウスを作製し、脳毛細血管を単離してLC-MS/MSを用いてP-gpの絶対発現量を計測した結果、正常時とほぼ同程度であった。これに正常時のP-gp単分子活性と炎症マウスの血漿中・脳内非結合型分率を統合し、薬物速度論的モデルに基づきP-gp基質ベラパミルの脳/血漿中濃度比(Kp値)を再構築し、炎症モデルマウスにおける実測値と比較した結果、再構築値は実測値に比べて有意に小さく、再構築できない事が示された。つまり炎症時のP-gp単分子活性は正常時に比べて小さい事が示唆された。
Caveolin-1のリン酸化量に依存してP-gp単分子活性が変動する可能性があると考えられたため、caveolin1のリン酸化を定量すれば病態時の単分子活性を解明できると予想された。そこで、caveolin1のリン酸化部位Tyr6, Tyr14, Tyr25及びTyr42に対する定量用リン酸化ペプチドを作製し、LC-MS/MS絶対定量系を構築した。リン酸化濃縮技術HAMMOC法と組み合わせる事で、最高で20 attomole/ug proteinの発現まで定量可能な、リン酸化caveolin1の超高感度絶対定量系を確立する事に成功した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

平成24年度いっぱいで実施予定であった計画が平成24年度の早期に完了した。当初、0.1-1 fmol/ug protein程度のリン酸化caveolin1を定量可能な測定系の確立を目標としてきたが、HAMMOC法によるリン酸化ペプチド濃縮技術の最適化を行った結果、20 attomole/ug proteinまで検出可能な定量系を実現することができた。これにより、少なくとも0.1%のリン酸化割合まで定量可能な超高感度定量系が実現した。以上の事から、当初の計画以上に進展している。

今後の研究の推進方策

基本的に、交付申請書に記載したとおりに推進する予定である。
平成25年度は、リン酸化Caveolin1によるP-gpの単分子活性変動機構に基づいて、病態(炎症)モデルマウスにおける脳関門P-gp輸送活性を再構築できるか否かを解明する。In vitro脳毛細血管モデル細胞に病態関連物質を暴露させ、輸送解析と発現量解析を実施し、P-gp発現量で除した見かけの基質排出輸送速度を求め、これが病態関連物質の暴露によって変化することを確認する。これと同じ病態条件下において、caveolin1のTyr6, Tyr14, Tyr25, Tyr42の中からリン酸化量の変動するリン酸化部位を同定し、単分子輸送活性に影響を与えるリン酸化部位として同定する。同定されたリン酸化部位について、P-gp発現量で除した見かけの排出輸送速度とリン酸化量の相関関係を明らかにする。得られた相関関係に、正常および病態モデルマウスにおける脳毛細血管のリン酸化量を照らして、病態モデルマウスにおける単分子輸送活性の低下率を算出する。平成23年度の研究で得られている正常時P-gpの単分子輸送活性にこの低下率を乗ずることによって、病態(炎症)時の脳関門のP-gp単分子輸送活性を得る。この値に、平成24年度の研究で示された病態(炎症)時のP-gpタンパク質発現量と蛋白質非結合型分率を統合することによって病態(炎症)時のP-gp基質の脳/血漿中濃度比(Kp値)を再構築し、Kp値の実測値と一致するか否かを明らかにする。
以上の実験によって、薬物脳移行性の病態変動メカニズムが解明され、病態時における脳への薬物移行量を予測する基盤が確立し、本研究の目的が達成される。

次年度の研究費の使用計画

平成24年度と同様に、平成25年度中に特に変更がなければ、研究遂行のために、交付額が年度末に0になるように計画的に使用する予定である。

  • 研究成果

    (26件)

すべて 2013 2012 その他

すべて 雑誌論文 (10件) (うち査読あり 5件) 学会発表 (16件) (うち招待講演 1件)

  • [雑誌論文] Quantitative atlas of blood-brain barrier transporters, receptors and tight junction proteins in rats and common marmoset.2013

    • 著者名/発表者名
      Y Hoshi, Y Uchida, M Tachikawa, T Inoue, S Ohtsuki, T Terasaki
    • 雑誌名

      J Pharm Sci.

      巻: in press ページ: in press

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Blood-brain barrier (BBB) pharmacoproteomics: a new research field opened up by quantitative targeted absolute proteomics (QTAP).2013

    • 著者名/発表者名
      Y Uchida, M Tachikawa, S Ohtsuki, T Terasaki
    • 雑誌名

      IN Drug Delivery to the Brain-Physiological Concepts, Methodologies and Approaches

      巻: in press ページ: in press

  • [雑誌論文] Recent progress in blood-brain barrier and blood-CSF barrier transport research: Pharmaceutical relevance for drug delivery to the brain.2013

    • 著者名/発表者名
      M Tachikawa, Y Uchida, S Ohtsuki, T Terasaki
    • 雑誌名

      IN Drug Delivery to the Brain-Physiological Concepts, Methodologies and Approaches

      巻: in press ページ: in press

  • [雑誌論文] Identification of transporters associated with etoposide sensitivity of stomach cancer cell lines and methotrexate sensitivity of breast cancer cell lines by quantitative targeted absolute proteomics.2013

    • 著者名/発表者名
      Obuchi W, Ohtsuki S, Uchida Y, Ohmine K, Yamori T, Terasaki T
    • 雑誌名

      Mol Pharmacol

      巻: 83 ページ: 490-500

    • DOI

      10.1124/mol.112.081083

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model2013

    • 著者名/発表者名
      Ohtsuki S, Ikeda C, Uchida Y, Sakamoto Y, Miller F, Glacial F, Decleves X, Scherrmann JM, Couraud PO, Kubo Y, Tachikawa M, Terasaki T
    • 雑誌名

      Mol Pharm

      巻: 10 ページ: 289-296

    • DOI

      10.1021/mp3004308

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Quantitative targeted absolute proteomics-based large-scale quantification of proline-hydroxylated α-fibrinogen in plasma for pancreatic cancer diagnosis.2013

    • 著者名/発表者名
      Yoneyama T, Ohtsuki S, Ono M, Ohmine K, Uchida Y, Yamada T, Tachikawa M, Terasaki T
    • 雑誌名

      J Proteome Res

      巻: 12 ページ: 753-762

    • DOI

      10.1021/pr3008144

    • 査読あり
  • [雑誌論文] 動的インターフェースとしての脳関門輸送システムと脳関門生理学・創薬研究2013

    • 著者名/発表者名
      立川正憲、内田康雄、寺崎哲也
    • 雑誌名

      Brain and Nerve

      巻: 65 ページ: 121-136

  • [雑誌論文] Quantitative Proteomics of Transporter Expression in Brain Capillary Endothelial Cells Isolated from P-gp, Bcrp, and P-gp/Bcrp Knockout Mice.2012

    • 著者名/発表者名
      Agarwal S, Uchida Y, Mittapalli RK, Sane R, Terasaki T, Elmquist WF.
    • 雑誌名

      Drug Metab Dispos

      巻: 40 ページ: 1164-1169

    • DOI

      10.1124/dmd.112.044719

    • 査読あり
  • [雑誌論文] LC-MS/MS-based blood-brain barrier transporter study.2012

    • 著者名/発表者名
      Y Uchida
    • 雑誌名

      Drug Delivery System

      巻: 27 ページ: 316-317

  • [雑誌論文] 定量的絶対標的プロテオミクスに基づくトランスポーター研究の新展開2012

    • 著者名/発表者名
      内田康雄、立川正憲、寺崎哲也
    • 雑誌名

      細胞工学

      巻: 31 ページ: 587-588

  • [学会発表] 膵癌細胞のゲムシタビン感受性増強を目的とした併用薬のスクリーニング2013

    • 著者名/発表者名
      黒田広樹、立川正憲、内田康雄、寺崎哲也
    • 学会等名
      日本薬学会第133年会
    • 発表場所
      横浜
    • 年月日
      20130327-20130330
  • [学会発表] ヒト血液脳関門FATP1/SLC27A1を介したdocosahexaenoic acidの輸送2013

    • 著者名/発表者名
      落合祐介、 内田康雄、立川正憲、大槻純男、寺崎哲也
    • 学会等名
      日本薬学会第133年会
    • 発表場所
      横浜
    • 年月日
      20130327-20130330
  • [学会発表] 仮想selective reaction monitoring法を用いた白血球細胞膜上タンパク質の高感度標的プロテオミクス2013

    • 著者名/発表者名
      佐藤和貴、立川正憲、内田康雄、大槻純男、寺崎哲也
    • 学会等名
      日本薬学会第133年会
    • 発表場所
      横浜
    • 年月日
      20130327-20130330
  • [学会発表] ヒト、カニクイザル、マーモセット、ラット及びマウスの血液脳関門におけるトランスポーターのタンパク質発現量の種差の解明2013

    • 著者名/発表者名
      内田康雄、星裕太朗、伊藤克彰、大槻純男、勝倉由樹、池田千絵美、立川正憲、鈴木貴、上家潤一、井上貴史、寺崎哲也
    • 学会等名
      日本薬学会第133年会
    • 発表場所
      横浜
    • 年月日
      20130327-20130330
  • [学会発表] 標的プロテオミクスに基づく組織細胞特異的ヘミチャネル発現プロファイルの構築2013

    • 著者名/発表者名
      立川正憲、金子洋介、内田康雄、大槻純男、寺崎哲也
    • 学会等名
      日本薬学会第133年会
    • 発表場所
      横浜
    • 年月日
      20130327-20130330
  • [学会発表] LC-MS/MS-based quantification of proline-hydroxylated α-fibrinogen in plasma for pancreatic cancer diagnosis2012

    • 著者名/発表者名
      米山敏広、 大槻純男、 尾野雅哉、 大峰健、 内田康雄、立川正憲、寺崎 哲也
    • 学会等名
      第6回次世代を担う若手医療薬科学シンポジウム
    • 発表場所
      京都
    • 年月日
      20121123-20121124
  • [学会発表] In vitro-to-in vivo reconstruction (IVIVR) of brain distribution for dual P-gp and BCRP substraes based on pharmacoproteomic (PPx) approach2012

    • 著者名/発表者名
      Uchida Y., Ohtsuki S., Terasaki T
    • 学会等名
      日本薬物動態学会第27年会
    • 発表場所
      千葉
    • 年月日
      20121120-20121122
  • [学会発表] Quantitative targeted absolute proteomics of blood-brain barrier transporters in common marmoset, two rat and three mouse strains.2012

    • 著者名/発表者名
      Hoshi Y., Uchida Y., Tachikawa M., Ohtsuki S., Inoue T., Terasaki T
    • 学会等名
      日本薬物動態学会第27年会
    • 発表場所
      千葉
    • 年月日
      20121120-20121122
  • [学会発表] Functional expression of pannexin an connexin hemichannels at the human blood-brain barrier.2012

    • 著者名/発表者名
      Tachikawa M., Kaneko Y., Uchida Y., Ohtsuki S., Couraud P.O., Terasaki T
    • 学会等名
      日本薬物動態学会第27年会
    • 発表場所
      千葉
    • 年月日
      20121120-20121122
  • [学会発表] Laser caputure microdissection-based quantitative targeted proteomics for drug metabolizing enzymes and transporters in the liver.2012

    • 著者名/発表者名
      Hakata Y., Tachikawa M., Uchida Y., Ohtsuki S., Terasaki T
    • 学会等名
      日本薬物動態学会第27年会
    • 発表場所
      千葉
    • 年月日
      20121120-20121122
  • [学会発表] Targeted quantitative LC-MS/MS methods of bevacizumab, a therapeutic monoclonal antibody.2012

    • 著者名/発表者名
      Ebata Y., Ohtsuki S., Tachikawa M., Uchida Y., Terasaki T.
    • 学会等名
      日本薬物動態学会第27年会
    • 発表場所
      千葉
    • 年月日
      20121120-20121122
  • [学会発表] Pathophysiological impact of hemichannels on the blood-brain barrier transport.2012

    • 著者名/発表者名
      Tachikawa M., Kaneko Y., Uchida Y., Couraud P.O., Terasaki T
    • 学会等名
      Fifteenth International Symposium Signal Transduction in the Blood-Brain Barriers
    • 発表場所
      Potsdam, Germany
    • 年月日
      20120913-20120916
  • [学会発表] Quantitative targeted absolute proteomics of human, monkey and mouse blood-brain barrier transporters2012

    • 著者名/発表者名
      Uchida Y., Ito K., Ohtsuki S., Katsukura Y., Ikeda C., Suzuki T., Kamiie J., Terasaki T
    • 学会等名
      Human Proteome Organization (HUPO) 11th Annual World Congress
    • 発表場所
      Boston, USA
    • 年月日
      20120909-20120913
  • [学会発表] Reconstruction of drug distribution in monkey brain based on absolute quantification of MDR1 expression at blood-brain barrier2012

    • 著者名/発表者名
      Uchida Y., Wakayama K., Ohtsuki S., Ohe T., Chiba M., Ishii Y., Terasaki T
    • 学会等名
      Gordon Research Conference, Barriers of the CNS
    • 発表場所
      New London, USA
    • 年月日
      20120617-20120622
  • [学会発表] IVIVE of Transporters - Part III (IVIVE of transporters)

    • 著者名/発表者名
      内田康雄
    • 学会等名
      第3回Simcyp東京ワークショップ
    • 発表場所
      東京
    • 招待講演
  • [学会発表] ヘミチャネルファミリーを標的とした定量プロテオミクス

    • 著者名/発表者名
      立川正憲、金子洋介、内田康雄、寺崎哲也
    • 学会等名
      日本薬学会東北支部大会
    • 発表場所
      青森

URL: 

公開日: 2014-07-24  

サービス概要 検索マニュアル よくある質問 お知らせ 利用規程 科研費による研究の帰属

Powered by NII kakenhi