2011 年度実施状況報告書

グリア細胞の活動が調節するシナプス形成機構の解明

研究課題

研究課題/領域番号	23790257
研究機関	明治薬科大学
研究代表者	小川泰弘明治薬科大学, 薬学部, 助教 (00531948)
研究期間 (年度)	2011-04-28 – 2014-03-31
キーワード	脳・神経 / シナプス / グリア細胞 / アストロサイト / イオンチャネル
研究概要	近年ニューロンの情報のやり取りの場であるシナプスにおいてアストロサイトがその情報伝達に対し、積極的に影響を与えていることが明らかになってきた。よって、in vivoにおいて標的とするアストロサイトの活動を制御することでアストロサイトがシナプスに対しどのような影響を与えるかを検討することは、実際の脳でのシナプス制御機構を解明するために非常に重要な知見を与える。そこで本研究では、in vivoにおけるアストロサイトのシナプスに対する影響を、アストロサイトの活動を抑制的に制御することで解明することを目的としている。平成23年度は、まず1. in vivoにおいて標的ニューロンのみのシナプス制御機構を検討するシステムの構築、2. 標的ニューロならびに標的アストロサイトのみのRNAを回収し解析するためのシステムの構築、さらに3. 長期的に抑制できるシステムの構築を目標に行った。具体的には、1. シナプス形成を検討する目的で、シナプス後膜足場タンパク質であるPSD-95及びPSD-93をクローニングし、2.　In vivoにおいて標的細胞のみのRNAを回収するためにmRNA結合分子であるL10Aをクローニングした。これら3点にGFPタンパク質を融合したアデノウイルス発現ベクターを作製した。これらのベクターを、in vivo脳に導入し発生学的にシナプス局在性などを解析した。次に3.　標的細胞のみを抑制的に制御するために薬物感受性Cl-イオンチャネルのアデノウイルス発現系を構築したが成功しなかったため、引き続き複数種のウイルス発現系を検討するとともにトランスジェニックマウスの作製を開始した。次年度以降は、作製されたトランスジェニックマウスを確定し、これを用いてin vivoにおけるアストロサイトの長期的抑制を行いシナプスに対する影響を既に構築したアデノウイルスを用いて解析する。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由本研究はin vivoにおいてアストロサイトの活動を制御し、実際の脳において標的ニューロンのシナプス形成や標的ニューロン及びアストロサイトのトランスクリプトーム解析を検討することを目的としている。平成23年度は、この目的を達成するためのツールを作製しこれが実験系として確立できるかを検討した。その結果、シナプス形成及びトランスクリプトーム解析を行うための各種アデノウイルス発現ベクターの作製は完了し、さらに先行して、これらのin vivoでの確認も完了している。次に、今回用いるアストロサイトを抑制的に制御する薬物感受性イオンチャネルにおいては、既にin vitroの実験において機能することの確認が済んでいる。また、薬物感受性イオンチャネルを発現するためのアデノウイルスベクターは成功しなかったが、これに関しては、エレクトロポレーション法並びに他発現ベクター系にて代替え可能であること、さらに、より実験系を高精度におこなうための細胞特異的に薬物感受性イオンチャネルを発現するためのトランスジーンを作製し、現在これを用いてトランスジェニックマウスの作製に着手している。以上より、本年度の研究達成度は概ね順調に進展しているか、やや先行して進展しているものと判断する。
今後の研究の推進方策	平成23年度において、既にin vivoでのシナプス形成の検討を確認している。よって、平成24年度以降は、in vitroでの検討のためのニューロン―グリア細胞の共培養だけでなく、実際にin vivoにおいてアストロサイトの活動を抑制的に制御することを行う。具体的には、イベルメクチンによって制御可能なイオンチャネルを発現させたマウスの胎仔に対し、既に構築したシナプス形成を検討するアデノウイルス発現ベクターを導入し発生させる。４-6週齢まで飼育した後、イベルメクチン存在下／非存在下でのアストロサイトの活動を抑制的に制御する。この際、標的ニューロンにおけるシナプス形成の形態的な観察を行い、免疫沈降法を用いてNMDA及びAMA受容体などの局在比をウエスタンブロッティング法により検討する。これをイベルメクチンの投与期間を変更することで継時的に観察する。トランスクリプトーム用の発現アデノウイルスをマウス胎仔脳ならびに成獣大脳皮質等に導入し、同様にイベルメクチンによる制御を行ったのち、標的ニューロン及びアストロサイトのmRNAを回収しマイクロアレイ等差次的解析を行う。
次年度の研究費の使用計画	ニューロン―グリア細胞共培養、アデノウイルスの調整のための培養ならびに精製、標的シナプスの免疫沈降とこれに含まれるタンパク質の解析のために、免疫沈降ビーズ及び抗体の購入と質量分析の受託解析、マイクロアレイ等の解析に平成24年度の研究費を使用する。