| 研究課題/領域番号 |
23790439
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| 研究機関 | 浜松医科大学 |
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研究代表者 |
倉部 誠也 浜松医科大学, 医学部, 助教 (60466737)
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| 研究期間 (年度) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| キーワード | レトロトランスポゾン / LINE-1 / インバースPCR |
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| 研究概要 |
１研究の意義、重要性 ゲノムの不安定性は重要な癌制御メカニズムのひとつであり、一般的には染色体の分配機構や中心体の制御が関与していることが知られているが、動く遺伝子であるレトロトランスポゾンの影響も重要である事が示唆されている。本研究は従来法よりも短時間にハイスループットで解析が可能な手法を用いて、レトロトランスポゾンであるlong interspersed element-1(LINE-1)と発癌、転移との関わりを解析する。はじめに、癌や転移に特異的に存在するL1を同定し、次に同定したLINE-1が発癌、転移の原因となるか検証する。２研究成果についての具体的内容 インバースPCR法でLINE-1の挿入位置を同定できるのでこれを利用した。申請者の研究室には大量のヒトゲノムDNA（癌と正常部位）が肺癌でそろっているのでこれらを使用した。具体的には、ゲノムDNAを制限酵素Sau3AIで切断しセルフライゲーション後、LINE-1の3’側に設定したプライマーでPCRを行った。PCR産物を電気泳動し正常と癌部位を比較し、癌や転移特異的なLINE-1の検出を試みた。効率を上げるためゲノムDNAは異なる10サンプルを混合してインバースPCRを行った。癌と正常部のペアを合計67ペア解析したが、癌特異的なLINE-1は発見できなかった。そこで研究が計画通りに進まない場合の解決策として予定していたリンカーDNAをライゲーションする方法を試みた。この方法では同定できるLINE-1の数が増加し癌特異的なLINE-1が発見できる可能性がある。現在この方法でのLINE-1の検出を行っている。さらに現在サンプルは電気泳動をして正常と癌の比較を行っているが、今後はイルミナ社の次世代シークエンサーMiSeqを用いてサンプルのシークエンスとアラインメントを行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
インバースPCR法で癌特異的なLINE-1の挿入位置を同定しようと試みたが、同定が出来なかった。そのため解決策としてのリンカーDNAライゲーションを行い、癌特異的なLINE-1の同定が現在も進行中であり23年度中に癌特異的なlINE-1の同定が出来なかったため。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在進行中であるリンカーDNAライゲーションによる癌特異的なLINE-1の同定を継続して行う。その際に次世代シークエンサーの利用を予定している。同定できた際にはそのLINE-1の配列を単利し、癌特異的LINE-1挿入位置の近傍に存在する遺伝子の発現を解析する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
インバースPCR等の分子生物学的実験に対する消耗品として当該研究費が生じた。また、次年度もリンカーDNAライゲーションや次世代シークエンサー等の分子生物学的な消耗品に対して研究費を使用する。また、研究成果を公表するための学会発表の旅費にも研究費を使用する予定である。
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