細胞内適応変異導入によるＪＦＨー１株以外の新規Ｃ型肝炎ウイルス感染増殖系の樹立

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 23790513
• 研究機関: 国立感染症研究所
• 研究代表者: 村山 麻子 国立感染症研究所, ウイルス第二部, 協力研究員 (40415534)
• キーワード: C型肝炎ウイルス

研究概要

本研究ではJFH-1株以外のウイルス株を用いたHCV感染増殖系の樹立を目的としている。本年度は昨年度に樹立した遺伝子型2aのJ6株を用いた感染増殖系において必要な変異の解析を行った。
遺伝子型2aのJ6株は、培養細胞では自律複製できないが、NS3ヘリカーゼ領域(N3H)とNS5B-3’X領域(N5BX)をJFH-1株に置換するとウイルス産生が可能であった(Murayama et al., JVI 2007)。さらに、N5BXのJFH-1株への置換は、NS5B領域内の3つのアミノ酸置換と、3’UTR内の塩基置換で代用できることを示した(Murayama et al., PLoS Pathog 2010)。昨年度はJ6株を培養細胞で複製可能にする変異を同定することを目的とし、J6CF株の5B領域の一部をJFH-1株と置換したJ6/5BSLX-JFH1のRNAを導入した細胞を継代培養し、感染性ウイルスを得た。ウイルスゲノムのシークエンス解析により、NS4A領域の変異が同定され、この変異を含めた5カ所の変異を導入したJ6m株は培養細胞で複製できた。本年度は、昨年度に同定したNS4Aの変異の機能について解析した。タグ付加したNS4Aを用いてNS4Aの変異が局在に及ぼす影響を解析したが、NS4Aの局在自体に変化はなかった。そこでmKGシステムを用いてNS3-NS4A間の相互作用へのNS4Aの変異の影響を観察した。その結果、J6株ではNS3-NS4A間の共局在が見られないが、NS4Aの変異により共局在がみられることから、この変異はNS3-NS4A間の相互作用を強め、複製が可能となることが示唆された。
初年度に樹立したMA株に続き、J6株を用いた感染増殖系が樹立できたことにより、HCVの生活環における遺伝子型またはウイルス株による差異や、薬剤感受性の違いについての比較検討が可能となった。

研究成果

• [雑誌論文] Single strain isolation method for cell culture-adapted hepatitis C virus by end-point dilution and infection (2014)
  • 著者名/発表者名: Sugiyama N, Murayama A, Suzuki R, Watanabe N, Shiina M, Liang TJ, Wakita T, Kato T
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 9(5) ページ: e98168
• [雑誌論文] Involvement of Hepatitis C Virus NS5A Hyperphosphorylation Mediated by Casein Kinase I-α in Infectious Virus Production (2014)
  • 著者名/発表者名: Masaki T, Matsunaga S, Takahashi H, Nakashima K, Kimura Y, Ito M, Matsuda M, Murayama A,Kato T, Hirano H, Endo Y, Lemon SM, Wakita T, Sawasaki T, Suzuki T
  • 雑誌名: Journal of Virology 巻: in press ページ: in press
  • 査読あり
• [雑誌論文] NS5B-RNAポリメラーゼの構造と機能 (2013)
  • 著者名/発表者名: 村山麻子、加藤孝宣
  • 雑誌名: 肝胆膵 巻: 67(6) ページ: 918-923
• [学会発表] An adaptive mutation in NS4A region enhances Hepatitis C Virus replication and virus production in cell culture (2013)
  • 著者名/発表者名: 村山麻子、杉山奈央、脇田隆字、加藤孝宣
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 20131203-06
• [学会発表] HCV NS5Aキメラウイルスを用いた第二世代NS5A阻害剤の抗ウイルス活性の評価 (2013)
  • 著者名/発表者名: 村山麻子、杉山奈央、脇田隆字、加藤孝宣
  • 学会等名: 第61回日本ウイルス学会学術集会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 20131110-12
• [学会発表] Evaluation of second-generation NS5A inhibitors against hepatitis C virus by using NS5A replaced JFH-1 viruses and full-length infectious clones other than JFH-1 (2013)
  • 著者名/発表者名: Murayama A, Sugiyama N, Wakita T, Kato T
  • 学会等名: 64th Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver Diseases
  • 発表場所: Washington D.C., USA
  • 年月日: 20131102-05
• [学会発表] Assessment of antiviral activities of NS5A inhibitors on recombinant HCV replaced with NS5A from genotypes 1 and 2 strains (2013)
  • 著者名/発表者名: Murayama A, Sugiyama N, Masaki T, Wakita T, Kato T
  • 学会等名: 20th International Symposium on Hepatitis C and Related Viruses
  • 発表場所: Melbourne, Australia
  • 年月日: 20131006-10
• [学会発表] Identification of cell-culture adapted hepatitis C virus JFH-1 variants by single virus isolation with end-point dilution method (2013)
  • 著者名/発表者名: Sugiyama N, Murayama A, Suzuki R, Shiina M, Wakita T, Kato T
  • 学会等名: 20th International Symposium on Hepatitis C and Related Viruses
  • 発表場所: Melbourne, Australia
  • 年月日: 20131006-10